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植物組織培養論文:植物組織培養褐變產生探究論文
論文關鍵詞:植物組織培養褐變酚類物質多酚氧化酶醌類物質
論文摘要:植物組織培養過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現象并稱為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題，本文結合相關資料，對影響褐變的因素作了分析，褐變的影響因素是復雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表面培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2褐變產生的機理
2.1非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，并不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由于多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
3.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。
3.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
4.1適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天后再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
4.3適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
4.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
4.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
4.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
4.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發生[10]。
4.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
4.4添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。
4.5進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
植物組織培養論文:植物組織培養管理論文
論文關鍵詞:植物組織培養褐變酚類物質多酚氧化酶醌類物質
論文摘要:植物組織培養過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現象并稱為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題，本文結合相關資料，對影響褐變的因素作了分析，褐變的影響因素是復雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表面培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2褐變產生的機理
2.1非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，并不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由于多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
3.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。
3.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
4.1適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天后再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
4.3適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
4.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
4.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
4.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
4.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發生[10]。
4.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
4.4添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。
4.5進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
植物組織培養論文:瀕危植物南川木菠蘿組織培養技術研究
摘要 南川木菠蘿是我國最為珍稀的特有極危物種之一，開展其組織培養研究具有十分重要的意義。從外植體選擇到幼苗移栽，對南川木菠蘿組織培養各相關環節進行了研究。首次建立起了南川木菠蘿的組織培養體系。結果表明：南川木菠蘿組織培養適宜的外植體為帶芽莖段，并探明了獲得無菌外植體的方法；南川木菠蘿愈傷培養的挑選培養基為WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3） mg/L 6-BA+3 g/L PVP，芽誘導挑選培養基為WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP，生根挑選培養基為WPM+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 g/L PVP；適宜的組培苗煉苗時長為6～9 d，使用滅菌營養土較好，移栽存活率可達90%以上。
關鍵詞 瀕危植物；南川木菠蘿；組織培養
南川木菠蘿（Artocarpusnanchuanensis S.S.Chang），別名南川面包樹、水冬瓜、瓜瓢、大楊梅，是多年生高大喬木植物，系?？撇_蜜屬中分布在我國最北端的植物種。1989 年由中國科學院昆明植物研究所吳征鎰院士和張秀實教授在《云南植物研究》11 卷第1 期上正式發表定為?？频囊粋€新種[1]。2004年，南川木菠蘿被《中國物種紅色名錄》確定為“極?！蔽锓N，是我國最為珍稀的特有植物之一[2]。目前報道，主要分布于重慶部分區、縣[3]，已發現并得到良好保護的野生南川木菠蘿有6 個居群，結果母樹100株左右[4]。
目前，野生資源調查顯示南川木菠蘿喜光，耐貧瘠；散生于海拔900 m以下的山地、丘陵[3]；樹干直立、粗壯，樹高可達25 m以上，樹干胸徑可達60 cm以上，低分枝，樹葉繁茂；葉革質，長圓形、橢圓形或近圓形，表面光滑，葉綠色或濃綠色（圖 1）。因此，南川木菠蘿表現出樹形美觀，抗逆性強，病蟲害極少，具有較好的園林景觀和生態效應，是難得的行道樹、庭園綠化的品質樹種。2008 年重慶市將其確定為主城新城區9 個基調樹種之一[2-3]。另外，南川木菠蘿果實形似面包（圖 1），具有較高的營養和醫用保健價值，含有人體必需的多種糖、蛋白質、氨基酸和酯類以及一些人體所必需的微量元素和多種維生素，可加工調制出風味獨特、品質優良的果酒、果汁、果脯及果醬等；通便通氣的效果明顯，對便秘等腸道疾病具有較好的控制作用，民間使用表明，其樹皮和樹根對人體的皮膚病有較好的療效。其木材紅棕色，紋理細密、質地堅硬，可用來制作家具。因此，南川木菠蘿可以從園林、飲料食品、醫藥保健、經濟木材等方面進行開發利用[3]。南川木菠蘿的價值逐漸引起了相關單位的關注并初步展開了引種工作。例如，貴州亞熱帶作物生物質能源研究所周正邦等[5]研究表明，南川木菠蘿可以成功引種到貴州望謨和興義等地，這對貴州熱區生態建設、特色農業開發等具有重要意義。為增加貴州特色優新物種，同時引種的太平洋面包樹則不能安全越冬。
但是，南川木菠蘿種子具有休眠特性，少數休眠期可長達1年，發芽出苗不一致。因此，南川木菠蘿的自然更新和繁衍能力極差。人工繁殖多為播種繁殖，秋播采用隨采隨播，春播需要進行沙藏處理?？汕げ宸敝?，但成活率低[3]。相關單位對這一珍稀物種資源進行了多年的調查研究，南川木菠蘿的種子繁殖技術取得了某些階段性成果[2]，形成了扦插繁殖方法，但扦插成活率僅50%左右[6]，其繁殖受到季節影響，且需要大量土地和人工，不利于規?；a。因此，建立南川木菠蘿的組織培養技術可很好地保護南川木菠蘿這一瀕危植物資源，解決產業開發所需種苗。
1 材料與方法
1.1 供試材料
試驗材料采集于重慶市綦江區東坡鎮南川木菠蘿野生群，選用10年以上南川木菠蘿植株的幼葉和幼嫩枝條進行組織培養體系的建立。將幼嫩枝條剪切成帶有1～2個芽、長3～6 cm的帶芽莖段和長2 cm左右的無芽幼嫩莖段。以南川木菠蘿幼葉以及制作好的帶芽莖段和無芽幼嫩莖段作為組織培養的外植體。
1.2 材料處理
1.2.1 無菌外植體的制作。將幼葉、帶芽莖段和無芽幼嫩莖段先用流水沖洗20 min，蒸餾水沖洗3～5次，然后在超凈工作臺用75%乙醇處理30～60 s，無菌水沖洗3次，再用 2%次氯酸鈉（滴加幾滴tween-20）處理10～15 min，無菌濾紙吸干水，接種至相應培養基上進行培養。
1.2.2 組織培養方法。消毒完成的帶芽莖段首先放入枝條生長培養基，再選取重新生長出來的幼葉切割成1～2 cm2的外植體進行愈傷誘導。直接從成年大樹上采集的幼葉和幼嫩莖段經過消毒處理后，幼葉切割為1～2 cm2，幼嫩莖段切割為1.5～2.0 cm直接進行愈傷誘導。外植體誘導形成的愈傷，再經過芽的分化誘導、生根培養及移栽成苗。
1.3 培養基配制
采用高壓蒸汽進行培養基滅菌，設定在121 ℃、0.105 MPa 的壓力下，滅菌15～20 min，滅好備用。
1.3.1 枝條生長培養基。以WPM（Woody Plant Medium）為基本培養基，附加3 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Polyvinylpyrr-olidone）。
1.3.2 愈傷誘導培養基。以WPM為基本培養基，pH值為5.7，附加6-BA和2，4-D或IAA，具體濃度設計組成如表1所示。PVP附加濃度為3.0 g/L。每個處理設計30個外植體，統計愈傷誘導率（愈傷誘導率=形成愈傷外植體數/總外植體數）。
1.3.3 芽誘導培養基。以WPM為基本培養基，pH值為5.8，附加不同濃度6-BA、NAA和3 g/L的PVP，6-BA設計5個濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，NAA設計2個濃度分別為0.1、0.2 mg/L，不同濃度的6-BA和NAA進行兩兩組合配制培養基。每種激素組合接種愈傷3瓶，每瓶接種帶有愈傷的外植體5塊，并統計芽誘導率。
1.3.4 生根培養基。以WPM為基本培養基，pH值為5.8，附加不同濃度IBA、NAA和3 g/L的PVP，IBA設計4個濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA設計2個濃度為0.1、0.2 mg/L。每個濃度處理使用20個幼苗，統計出根苗數，計算生根率[生根率（%）=生根苗數/總苗數×100]，3個月后結束生根統計。
1.4 培養條件
愈傷誘導階段采用暗處理，28 ℃，48 h，其他無菌培養條件為白天溫度25 ℃，夜晚18 ℃；光照強度1 000～2 000 lx；光暗周期15 h/9 h；相對濕度80%。瓊脂用量為6.0 g/L，培養基pH值5.8。
1.5 煉苗移栽
將盛放有生根的無菌南川木菠蘿幼苗的培養瓶去掉封口膜進行煉苗，煉苗后再移栽于營養土中生長。營養土使用patel peat（England newton international Group CO.，Ltd.），營養土處理設計滅菌（121 ℃、0.105 MPa，滅菌15 min）和不滅菌。煉苗時間長設計5個處理，分別為0、3、6、9、12、15 d，每個處理10株。統計移栽存活率[移栽存活率（%）=存活苗數/移栽總苗數×100]。
2 結果與分析
2.1 不同激素組合對南川木菠蘿愈傷誘導的影響
取無菌帶芽莖段新長出的嫩葉，并切割成約1.0 cm×1.5 cm大小的外植體，置于附加不同激素的愈傷培養基進行愈傷誘導。接種10～12 d后，葉片周圍明顯增厚，體積膨大，周圍先形成愈傷組織。30 d后進行愈傷誘導統計，結果表明不同激素和濃度其愈傷組織誘導率差異明顯，附加 2，4-D的培養基愈傷誘導率為17%～，而附加IAA的愈傷誘導率為7%～50%。附加2，4-D對南川木菠蘿葉片愈傷的誘導以2.0 mg/L水平好，平均誘導率約為98%，比1.0 mg/L和3.0 mg/L 2，4-D的平均誘導率分別高70、11個百分點。在研究中2，4-D對南川木菠蘿葉子的愈傷誘導效果比IAA好，其中WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3）mg/L 6-BA以及WPM+3.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA誘導率高達（表1）。
2.2 不同外植體南川木菠蘿的愈傷誘導
從母株上采取的嫩葉、無芽幼莖在各愈傷誘導培養基中培養7～10 d后表現出褐化現象（圖2A、B）；而帶芽莖段在枝條培養基培養20～25 d可長出新葉，再利用長出的新葉作為外植體可在愈傷培養基上形成良好愈傷（圖2C）。因此，本研究在進一步探索南川木菠蘿的組織培養體系時，以帶芽莖段長出的新葉為材料進行愈傷誘導、幼芽誘導及生根培養的研究。
2.3 不同激素組合對南川木菠蘿芽誘導的影響
在愈傷培養基中培養3～4周后轉入芽誘導培養基，不同激素組合的芽誘導培養基對愈傷組織培養的褐化程度不同，其中附加1.0 mg/L和5.0 mg/L的6-BA愈傷褐化程度較高，本研究使用的30個愈傷外植體沒有誘導出芽（圖2D），附加2.0 mg/L和3.0 mg/L的6-BA的培養基芽誘導效果較好（圖2F），其中培養基WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP芽誘導率較高，30個外植體可誘導60個芽。當提高6-BA附加濃度到4.0 mg/L，芽誘導率極低，30個外植體誘導出2個芽，且褐化較重（圖2E）。NAA的濃度以0.2 mg/L與6-BA 的組合，較適宜南川木菠蘿芽的誘導。
2.4 生根培養
當芽伸長到3～5 cm時，從基部切取幼苗，并帶少量愈傷接入生根培養基。不同激素對南川木菠蘿芽的根誘導，以培養基WPS+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 mg/L PVP效果好，生根率達75%，相對較高，1個月左右可使幼苗生根（圖2G、H），而附加1.0 mg/L的IBA培養基生根需要約2個月，且生根率為25%，相對較低。當基礎培養基中附加0.5、2.0 mg/L的IBA時，3個月內不能誘導出根。
2.5 幼苗馴化移栽
幼苗在生根培養基生長到6～8 cm時開始煉苗移栽，移栽前揭開封口膜進行煉苗。之后去掉大部分葉片和殘留培養基，保留2～3片葉移入滅菌營養土。本研究結果表明，滅菌營養土可以提高移栽存活率，在煉苗6 d的情況下，移栽15株幼苗存活14株，而使用未滅菌營養土移栽15株幼苗存活7株，可能由于滅菌營養土菌體相對較少，能更好使無菌苗適應由無菌環境轉入有菌環境。煉苗時間6～9 d比較適宜，在滅菌營養土中存活率可達90%，而0、3、12、15 d煉苗時長相應的存活率分別為10%、30%、50%、30%。當煉苗時間較短時進行移栽，幼嫩莖段易干枯，影響存活率，煉苗時間較長則容易長菌，而且失水嚴重，降低移栽存活率。苗期要注意保持水分，使營養土保持潤濕，移栽后約7 d即可恢復生長（圖2I）。
3 結論與討論
本研究建立的南川木菠蘿組織培養繁殖體系，幼葉愈傷率達，芽誘導率200%（30個愈傷外植體可誘導出60個芽），生根率達75%以上，移栽成活率90%以上。因此，可以利用該技術開展南川木菠蘿的規模化生產。本研究中無菌南川木菠蘿組培苗進行移栽時，使用滅菌營養土可以提高移栽成活率，可能由于滅菌營養土菌體相對較少，能更好使無菌苗適應由無菌環境轉入有菌環境。
南川木菠蘿是一種高大喬木植物，在進行組織培養時褐化現象比較嚴重。本研究表明，PVP、適當的激素濃度和配比可以一定程度減緩褐化現象，探索抑制組織培養中的褐化現象，將是改良南川木菠蘿組織培養技術的途徑之一。例如，本研究對愈傷進行芽誘導時，如果在芽誘導培養基中附加1.0 mg/L的6-BA，愈傷呈現發育緩慢，培養3 d左右即出現較嚴重的褐化現象，不能分化出芽；當6-BA濃度增加到3.0 mg/L時，褐化相對較輕，能分化出芽，可能與提高6-BA的濃度進而促進細胞分裂有關；當6-BA濃度增加到5.0 mg/L時，褐化相對1.0 mg/L的濃度輕，但較3.0 mg/L濃度嚴重，且發育緩慢，檢測的30個外植體中沒有芽的分化，可能是高濃度的6-BA破壞了組織發育的激素平衡?？扇苄跃垡蚁┻量┩橥≒VP）是酚類物質的專一性吸附劑，用于防止褐化的發生，PVP能減輕南川木菠蘿組織培養中的褐化率，2～5 g/L的濃度都有作用，以3 g/L效果較好。一些研究表明，除了聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、活性炭、Vc、檸檬酸等抗褐劑能減輕愈傷的褐化率[7-9]，褐化程度還與培養基中激素種類和濃度密切相關，合理使用激素能有效促進細胞生長，緩解褐化[10-12]。
植物組織培養論文:農村青年植物組織培養技術職業培訓存在的問題及改進措施
摘要 本文對農村青年中開展的植物組織培養技術培訓進行探討，分析了培訓過程中存在的問題，總結相應的改進措施和取得的成效，以期為后期該項技術的進一步培訓推廣提供參考。
關鍵詞 農村青年；植物組織培養；職業培訓；問題；措施；成效
植物組織培養技術是繁育苗木花卉種苗的一種新方法。它是在無菌的環境條件下，將離體的植物材料接種到人工合成的培養基上，并控制相應的溫度、光照、濕度等環境l件，使植物材料正常生長、分化并再生成完整植株的過程。植物組織培養技術對于植物優良品種的繁育、無病毒苗木生產、新品種選育、種質資源保存等方面有著較大的優勢，同時也產生了巨大的經濟效益和社會效益。目前，農村對于這項技術也在逐步推廣?，F就農村青年中對于植物組織培養技術職業培訓過程中存在的問題、解決措施及取得的成效進行探討，為后期的繼續培訓提供參考意見。
1 存在的問題
1.1 培訓教材選用不適
本期教材按照培訓大綱編寫，語言過分生硬，內容大多采用專業術語，使得本身文化水平偏低的農村青年在沒有接受專業教育的前提下難以接受授課教師在培訓時所述內容，并且不能夠理解教材上的專有名詞。培訓后學員也沒有花時間復習，導致學員所學知識都是一知半解，對于后面知識的進一步學習造成很大的障礙，導致即使是經過了系統培訓的學員也不能夠正確理解授課教師所述的內容，造成了學員在經過系統培訓后，并不能夠真正掌握這項技術[1-2]。
1.2 學員組織紀律渙散
本期所培訓的學員年齡大多在28周歲以上，由于與接受學校正規教育已有很長時間，所以突然集中學習則打不起精神?？紤]到學員白天在家要干農活，所以前期理論知識培訓都安排在19：00開始，雖然培訓時間安排在夜間，但是大多數學員仍有各種原因不能按時到場，即使到場的學員也不能夠認真聽取培訓教師的講解，導致培訓進度滯后[3-4]。
1.3 實踐操作動手能力差
由于植物組織培養對于實踐操作要求較高，所以在實踐操作中，采用先演示再逐個操作的流程進行。發現在操作過程中大部分學員并不能靈活使用各種接種器械和相關儀器，動作比較生硬、丟三落四，整個無菌操作不太標準和規范，導致組培試驗出現誤差，甚至整個試驗的失敗。同時，大部分學員理論和實踐過程中雖然遇到各種問題，由于思維方式的固定，并不能理解并接納教師的意見和建議，依然按照自己的想法進行，導致培訓結果不太理想。
1.4 思維方式局限
農村青年由于教育水平有限，認識面較窄，即使培訓教師在對基本問題進行講解時，他們也不能夠很好地去理解問題，客觀地面對問題，尋找解決問題的方法，在原本簡單的問題上卻要使用一成不變的方法，不能夠很好地運用科學思維方式來解決問題。這是他們一直以來所受到的教育方式及水平導致的，他們的思維方式受到一定的局限。
1.5 觀念滯后
農村青年因生活在科技文化普及滯后的農村，接觸植物組織培養技術之初并不能在觀念上引起他們的重視，面對新事物，他們并不確信這項新的技術能給他們帶來可觀的經濟收益，故而對培訓也只是抱著試試看的心態，這也就導致了培訓時不能很投入地認真學習。
2 改進措施及成效
針對上述存在的問題，采取了一系列措施，取得了良好的效果。
2.1 調整教材，改變教學方法
使用通俗易懂的語言改編教材，并且通過不斷的培訓，發現問題，及時找到教材的缺點并改正，盡量使得教材內容完整，使得農村青年在自己單獨閱讀的時候也能夠理解教材內容。同時，在培訓過程中，授課教師使用講解與視頻相結合的方法，圖文并茂，簡潔明了，既提高了學員的興趣，也使其逐步變被動學習為主動學習。
2.2 實踐與理論結合，增強動手能力
為了讓學員盡快在培訓過程中有效地將理論與實踐充分結合，掌握無菌操作的要點，特地選擇了不同植物的葉片、莖段、莖尖為外植體，從材料如何消毒到如何接種到培養瓶的相關步驟都是通過一個人現場操作，另一個在旁邊解說的形式完成。學員一邊拍照，一邊做記錄。講解完成后，學員親自開始操作，然后教師再針對操作中的問題，現場解答。通過3～4次課的學習后，發現學員已對整個無菌操作要點有所掌握，對于后期知識的進一步學習也變得容易多了。
2.3 大力宣傳現代農業技術，增強學習主動性
通過職能部門大力宣傳國家現代農業科學技術，降低現代農業成本，提高經濟效益，讓當代農村青年正確理解現代農業科學技術的重要性，發揮農村青年能吃苦的精神，為國家現代農業發展做出貢獻，使得農村青年正確認識現代農業科學技術，提高他們對現代農業技術的興趣，增強他們學習現代農業技術的主動性。
3 結語
通過對農村青年現代農業科技知識的培訓，能夠激發當代農村青年的學習積極性，從而讓他們重新拿起課本，接受現代農業的再教育，并進一步提高農村青年的創新精神，提升他們的實踐動手能力及創新意識，使其有效地認識到現代科技農業的發展，為利用新的方法繁育種苗和花卉打下堅實的基礎。
植物組織培養論文:植物組織培養技術在中藥資源中的應用
[摘要] 植物組織培養技術以其獨特的優勢被廣泛的應用于中藥資源領域，在中藥資源保護方面發揮了重要的作用。該文綜述了近年來植物組織培養的一些應用，包括植物組織培養生產藥用植物活性化合物、遺傳多樣性分析、道地藥材、誘導子應用、生物合成及轉基因植物等。通過以上研究將進一步促進植物組織培養技術的發展，使其在中藥資源領域發揮更大的作用。
[關鍵詞] 植物組織培養； 中藥資源； 誘導子； 生物合成
中藥資源是我國中藥產業的基石，隨著我國中藥工藝的快速發展，大型和超大型企業不斷涌現、形成和發展，對我國的中藥資源形成了很大的壓力，近些年中藥材瀕危資源的不斷增加，中藥材價格的不斷增長，足以表明我國資源保護和可持續利用工作的緊迫性和重要性。通過發展植物組織培養技術來解決中藥材的資源問題，對我國具有特殊而且重要的意義。植物組織培養技術的應用可以體現在以下幾個方面：①通過植物組織和器官培養生產活性成分，保護瀕危和珍稀藥用植物資源；②通過遺傳多樣性分析，對植物組織培養材料進行評價；③通過植物組織培養技術研究道地藥材遺傳機制和環境機制；④通過誘導子的添加提高培養物中活性成分含量；⑤利用植物組織培養物進行基因功能篩選、驗證及遺傳轉化研究。本文將從以上幾個方面綜述近年來植物組織培養技術在中藥資源領域中的應用。
1 植物組織培養生產藥用植物活性化合物
藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養技術是生產藥用植物次級代謝產物的一種非常有價值的工具。因此，通過細胞培養生產次級代謝產物的植物將近1 000種，超過600種的活性成分直接由植物細胞培養提供。目前，100多種毛狀根已經成功的被發根土壤農桿菌誘導[1]，主要通過優化培養基和關鍵生理因素去增加毛狀根培養的次級代謝產物的生成。目前，人參，三七，柴胡，甘草，丹參，雷公藤和許多種藥用植物已經制定了不定根培養體系。目前，為了大量的生產次級代謝產物，細胞、不定根、毛狀根已經成功地應用于大規模培養。例如，人參不定根培養已經達到3萬L。金絲桃不定根已經達到500 L，紫錐菊不定根已經達到1 000 L[2]。韓國，CBN生物科技公司，每年生產大約40～45 t人參不定根，這是一個利用植物組織培養生產藥品、食品和化妝品的成功范例。主要研究了培養條件的優化和誘導子的使用來提高次級代謝產物的含量。由WHO資助的半合成青蒿素已經被賽諾菲公司研制成功，其用發酵方法由單糖生產的青蒿酸在2013年已形成60 t左右產能。Phyton為成為世界經驗豐富的高品質紫杉醇生產商已進行了巨額投資。我國具有通過植物細胞發酵生產紫杉醇的巨大a能，杜絕了對紫杉樹種植的依賴，也避免了他們與環境、可持續性、性和質量穩定性相關的固有問題。近年來藥用植物細胞，毛狀根和不定根次級代謝產物的積累情況見表1。
近年來，藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養受到了廣泛關注，因為它提供了許多植物次級代謝產物?？偟膩碚f，藥用植物的細胞，毛狀根和不定根是逐年增加的，并且它的培養規模已經逐漸擴大。
2 遺傳多樣性分析
植物組織培養是植物快速大量增值的一種潛在工具，并且有利于控制重要次級代謝產物的生成。然而再生植株的遺傳基因會發生一定程度的變異，從而造成植株化學成分的改變及其臨床療效的差異，影響組織培養的優點[40]。因此，必須保障組培植株基因的一致性，以確保植株的質量。用于監測遺傳基因變化的方法有簡單重復序列，隨機擴增多態性DNA和相關序列擴增多態性。
簡單重復序列通常形成具有具體基因，少許具體標記物的種族。隨機擴增多態性DNA方法是一種PCR技術，隨機擴增DN段，使用低于低退火溫度的核苷酸序列的單一引物。這個技術已經廣泛用于種族分類，遺傳作圖和種系發生[41-42]。在吊燈花屬快繁的研究中，在植株的直接芽器官發生，間接芽器官發生和母本植物之間比較基因穩定性，結果顯示通過簡單重復序列和隨機擴增多態性DNA方法，直接芽器官發生的基因和母本植物是相似的，間接芽器官發生的隨機擴增多態性DNA指紋圖譜顯示出低的變異率[40]。相關序列擴增多態性是簡單的有效地生產高再生性和多功能性的全組基因片段。在人參懸浮細胞培養中，通過隨機擴增多態性DNA方法在懸浮細胞與幼苗之間比較基因穩定性，結果顯示懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[43]。在擬南芥懸浮細胞培養中，通過簡單重復序列方法來比較懸浮細胞和擬南芥植株的基因穩定性，發現懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[44]。
3 道地藥材
道地性歸根結底是道地藥材所擁有的基因型受到特定生境（道地產區）中環境因子誘導后表達的產物。因此，基因表達是道地藥材研究的重要環節，而功能基因表達的調控是道地藥材研究的目標之一[45]。揭示道地藥材和非道地藥材在基因表達方面的差異是道地藥材功能基因研究的重要內容。由于基因表達對研究所用RNA材料的要求較高，且通常需要通過對比實驗來完成，造成道地藥材基因表達及調控實驗目前主要集中在實驗室中。由于細胞培養和組織培養周期較短，材料易于獲得，均勻性較好，因此道地藥材功能基因表達與調控研究多是在植物組織和細胞中開展[46]。
例如，黃新等[47]利用mRNA差異顯示技術研究茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞mRNA表達的差異。李娟等[48]考察了碳源、氮源、有機成分對HBsAg轉基因人參細胞生長和HBsAg表達量的影響。劉峻等[49]研究了真菌誘導子影響人參毛狀根總皂苷的合成量。以上研究，雖然距離真正的實現道地藥材功能基因的表達和調控尚有一段距離，但為道地藥材功能基因表達和調控研究積累了思路和方法。
4 誘導子作用機制及其應用
4.1 誘導子的作用機制
誘導子被植物細胞膜或細胞質中的接受體識別后，細胞膜便開始去極化，引起離子通道的開閉，如Ca2+從環境中流入細胞質，K+和Cl-流出，或者通過 G 蛋白偶聯，激活第二信使系統，進一步的擴大這種效應，產生植物防御分子，如鈣離子（Ca2+）、活性氧（ROS）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、乙烯（ET）等，進而引起下游防衛基因的表達，改變相關酶的活性，并最終導致次級代謝產物的積累，見圖1[50]。
4.1.1 細胞內信號分子和作用機制 植物細胞信號分子主要作用偶合各種胞內外刺激，包括生物或者非生物刺激，再通過細胞內信號傳導系統使得刺激和細胞間信號級聯放大，最終導致相關酶活性的改變，進而引起一系列生理生化反應。例如，誘導子刺激后，細胞質中鈣離子（Ca2+） 濃度的升高、一氧化氮合成、活性氧迸發、茉莉酸合成途徑激活等，誘導防御基因的開啟，刺激代謝途徑中關鍵酶的合成，最終促進植物次級代謝產物的合成[51]。
鈣離子：誘導子刺激后，植物細胞在短時間內出現離子流，如Ca2+和H+從環境中流入細胞質，K+和Cl-流出等。這些Ca2+可以驅動鈣離子受體鈣調蛋白（CaM）的反應，一旦鈣調蛋白激活后，可以進一步激活與鈣調蛋白相關的蛋白激酶，從而引發蛋白的磷酸化，進而引起防御基因的表達[90]。例如，Ca2+含量迅速上升后，激活鈣調蛋白，會使大量的NAD（P）H氧化酶被激活，NADPH氧化酶可以催化過氧化物的產生和積累，從而進一步引起并下游一系列的反應，刺激次級代謝物的積累[52]。Ca2+內流以后，可作為信號分子激活磷脂酸 C，進而使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解產生 2 個第二信使： IP3（三磷酸肌醇）和 DAG（甘油二酯）。其中，DAG 可以與蛋白激酶結合，激活蛋白激酶 C，從而觸發蛋白磷酸化信號級聯，引起細胞內代謝物的積累。IP3 可以與細胞內鈣庫（如內質網、線粒體、葉綠體、液泡等）上的鈣離子通道受體結合，進而動員細胞內鈣庫中鈣離子的釋放。IP3-Ca2+信號途徑被認為是誘導植物抗毒素產生的調節物質[53]。在長春花懸浮細胞過程中加入真菌粗提物作為誘導子時，IP3信號轉導途徑被激活，從而進一步使長春花細胞中生物堿的含量提高[54]。
活性氧：植物防御早期的另一個重要變化是活性氧的迸發現象?；钚匝鯘舛壬呖梢宰鳛榈诙攀挂l胞內一系列抗性反應，如可以促進結構蛋白和木質素的合成使細胞壁增厚，細胞超敏死亡等，另外，活性氧介導的脂質氧化可以刺激茉莉酸及相關化合物的合成，誘導次級代謝防御基因和次生代謝物合成基因的表達，進而誘導次級代謝[55]。在紅豆杉細胞培養過程中，經尖孢鐮刀菌的細胞壁粗提物誘導后，紅豆杉細胞中活性氧大量積累，最終會導致細胞中紫杉醇的含量顯著上升，與對照相比提高了近4倍[56]。但是高濃度的活性氧，如 O2-，H2O2，OH-，1O2會損傷細胞內的成分?？寡趸阁w系，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD）以及過氧化氫酶 （CAT）等，會被激活，從而減輕活性氧的毒性作用，增強植物的耐受性[57]。在丹參細胞培養過程中，Dong等[58]發現在丹參細胞培養基中加入水楊酸，酚類化合物的含量會顯著增加，同時抗氧化物酶SOD，POD，CAT 的活性也會增加。
茉莉酸類：在許多的植物細胞培養體系中，誘導子都可以誘導內源的茉莉酸類物質的合成，其可作為細胞內和細胞間的信號分子，與轉錄因子相互作用，進而調節防御基因的表達，最終導致次生代謝物質的合成[59]。茉莉酸類也可以刺激次級代謝產物合成相關的基因的表達，從而促進一系列次級代謝產物的合成，包括萜類物質、黃酮類物質、生物堿和苯丙烷類物質[50]。在貫葉連翹細胞懸浮培養過程中，在培養基中加入黑曲霉細胞壁的粗提物作為誘導子時，茉莉酸的合成量迅速增加，同時細胞中金絲桃素的含量也迅速增加，而加入茉莉酸合成抑制劑后，細胞中金絲桃素的含量顯著下降[57]。
一氧化氮和水釧幔涸謐勻喚韁校水楊酸（SA）是植物與病原菌相互作用的誘導物，它能夠誘導發病機制相關 （PR） 基因的表達及和致病相關蛋白的產生，但是，水楊酸不是存在于所有植物防御代謝中[1]。研究發現，在部分植物的細胞中，水楊酸的迅速合成，可以誘導一些與代謝相關基因的表達，促使一些次生代謝產物的積累，例如，在茜草的培養過程中，SA可以增加細胞中蒽醌類物質的積累[60]。一氧化氮（NO）作為信號化合物，近年來才逐漸被認識。在植物體內，NO可以通過一氧化氮合成酶（NOS）、硝酸鹽還原酶（NR）或者非酶促反應來合成[59]。轉錄組測序的結果表明，NO處理后，可以引起植物細胞內與壓力和抗病性相關的基因的表達，說明了NO信號途徑可能與細胞內的次生代謝相關[61]。另外，NO還可以作用于水楊酸（SA）等信號分子的上游，參與和調控植物細胞中SA等信號分子的生物合成[62]。
真菌分泌物T導子是指將真菌的發酵液收集后，用4層紗布進行過濾，1萬×g 離心20 min后，用0.4 μm的濾膜進行過濾，用旋轉蒸發儀把過濾后的發酵液濃縮到一定體積，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。一般將滅活菌體發酵液在一定時間加入植物培養物培養基，處理一定時間來誘導植物培養物的生長以及次級代謝產物的積累。真菌分泌物體作為誘導子在植物組織培養中的應用，見表4。
4.2.3 非生物誘導子在植物組織培養中的應用 水楊酸（SA）和茉莉酸類化合物 [茉莉酸（JA），茉莉酸甲酯（MJ）]由于可以通過誘導多種植物次級代謝產物合成途徑中基因的表達來促進次級代謝產物含量的增加而廣為人知。除此之外，由于他們可以在低濃度誘導遠離他們合成部分的細胞反應，又被成為植物激素。其中，茉莉酸甲酯類應用最廣泛，目前已經成功應用于人參、柴胡、百部、甘草、西洋參、匙羹藤、柴胡、紫錐菊、雷公藤、睡茄、刺五加、苦艾和積雪草等植物組織培養中來提高細胞中次級代謝物的含量。
在苦艾懸浮細胞培養中，添加1.0 mg?L-1的茉莉酸以及茉莉酸甲酯可以使其總酚，總黃酮的含量增加，另外，可以提高自由基清除能力[97]。加入10 mg?L-1的茉莉酸甲酯到人參不定根的培養液中，人參皂苷約32 mg?g-1是空白組的4.76倍[98]。
化學合成誘導子一般指的是對已知的誘導子進行改造，通過化學合成，在誘導子分子結構上加入一些官能團等，來提高誘導子的誘導能力，增加藥用植物細胞中次級代謝物的積累。其中，最常見的是對茉莉酸甲酯的改造。例如，在三七懸浮細胞的培養過程中加入五氟丙基茉莉酸甲酯、2-羥乙基茉莉酸甲酯以及2-羥基乙氧基乙基，結果發現他們都能顯著增加人參皂苷的含量[99]。Qian等[100]考察了2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞中次級代謝產物的誘導作用，結果發現，2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯能顯著提高紅豆杉細胞中紫杉烷C的含量，質量分數分別達到44.3，39.7 mg?g-1，均高于對照組（茉莉酸甲酯處理組）的含量（質量分數分別為14.0，32.4 mg?g-1）。
除了常用的上述這些化合物外，還有一些物理因子如紫外光、溫度、超聲，金屬離子，水分，pH，鹽強，氣體如臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等都能提高次級代謝產物的含量。
5 生物合成生產藥用植物活性成分
由于生長受到自然環境的影響，許多藥用植物生長緩慢或栽培機制復雜。中藥材中的活性成分存在含量低、結構復雜、不穩定、很難化學合成或產率地下等缺點。利用生物技術生產活性成分有許多優點：包括生長周期短、生產標準化、質量穩定等，為中藥資源保護提供了新的途徑。隨著生物合成技術在青蒿素、紫杉醇，丹參酮和人參皂苷生物合成研究中的應用，預測生物合成技術將成為中藥可持續利用的重要途徑之一。近年來利用生物合成來生產活性成分的例子見表5。
藥用植物有效成分的生物合成是在基因組學的研究基礎上，通過在細胞中構建有效成分的生物合成途徑和代謝網絡，從而實現藥用有效成分的定向、高效的合成，以解決藥用有效成分的生產及藥物研發等一系列問題[52]。植物組織培養在生物合成中的應用包括功能基因的挖掘和基因功能體內驗證。
基因功能基因的挖掘主要是通過轉錄組測序來實現的。Subramaniyam等[101]對MJ處理不同時間的人參不定根進行了轉錄組測序，發現30個轉錄因子，11個GT與人參皂苷合成有關。Nuruzzaman等[102]對MJ處理過的人參不定根以及未處理過的不定根進行測序，發現48個轉錄因子與人參皂苷的合成相關。Jayakodi等[103]對2種人參材料誘導出的不定根以及栽培人參進行了轉錄組測序，發現不定根中90%的基因與數據庫得到一致，17%的基因是栽培品中所沒有的，此外還發現了一些與人參皂苷合成相關的候選功能基因。
基因功能的體內驗證主要是通過在植物組織培養器官體內進行基因沉默以及過表達來實現的。Park等[104]通過把CYP716A53v2基因在PCR 8.0中進行克隆，然后與pH2WG連接構建過表達載體，然后導入農桿菌中，侵染人參胚狀體，經過篩選得到CYP716A53v2過表達根系；另一方面，把CYP716A53v2基因進行沉默，構建相應的沉默載體導入農桿菌中繼而侵染人參胚狀體，經過篩選得到CYP716A53v2沉默根系。研究發現，過表達根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量高于正常根系，沉默根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量低于正常根系，說明CYP716A53v2基因的功能是轉化原人參二醇為原人參三醇。
植物組織培養論文:植物組織培養課程改革與實踐研究
摘要：本文把傳統的知識教學體系下的《植物組織培養》教學內容進行重構，從教學內容的設計、教學方法與手段以及課程考核等方面進行了改革，突出實踐性和技能性，取得了良好的教學效果。
關鍵詞：植物組織培養；教學改革；實踐研究
植物組織培養是20 世紀初發展起來的一門新技術，是現代生物技術的重要組成部分，經過幾十年的發展已經廣泛應用于農業、林業、工業與醫藥業中，尤其是在苗木脫毒、快速繁殖、新品種培育、植物次生代謝產物的生產等方面發揮著重要的作用，并創造了巨大的經濟效益與社會效益[1]，這使得近些年試管苗在國內外市場上已形成產業化，因而需要大量實踐能力強的植物組織培養技術技能型人才?！吨参锝M織培養》課程具有很強的專業性和實踐性，它對農林類高職學生實踐能力、創新能力和創業能力的培養，對產學研結合以及為農業產業和地方經濟建設服務具有重要的現實意義[2]。本課程教學圍繞植物組織培養工作崗位所需知識、能力及實際工作任務需要，重新構建了教學內容。培養學生掌握培養基成分、功能、無菌操作流程以及提高試管苗成活率措施等知識目標，達到學習儀器使用維護、培養基制備、無菌操作、試管苗移栽等基本能力目標，以及愛崗敬業、熱愛組培事業、團隊協作的基本素質目標。
1 課程改革的思路
課程組人員通過調研得知，從事植物組織培養工作的學生初次就業從事的工作任務，主要是進行培養基制備（母液配制）、無菌操作及組培苗培養、組培苗的移栽與管理，這也是植物組織培養的核心能力。所以，在進行課程改革的過程中，瞄準組織培養4個典型工作任務，即母液配制、培養基制備、無菌操作及組培苗培養、組培苗的移栽與管理來確定培養目標，對學生技能進行反復熟練、反復強化。在教學內容設計過程中，基于北方園藝果蔬花卉典型工廠化產品馬鈴薯、藍莓、蝴蝶蘭的生產項目為主體，重構課程內容。培養學生自主獲取信息、自主制定工作方案、自主完成組織培養中的典型工作任務、并能夠對過程進行檢查?？傮w思路為“一抓，二做，三融入”，即教師抓1個典型的項目，學生做2個典型的任務，融入理論、科研和大賽。內容設計從簡單到復雜至再提升的三級教學目標。
2 課程內容的設計
本課程把以往按照章節講授緒論、實驗室的構建和操作技術等七章內容，按照典型工作任務和典型生產項目把相關的內容進行整合，結合本專業的特點設計4個大的項目，9個子項目（見表1），規避了以往專業性不強，學生操作能力弱，教學內容重復的弊端，教師在每類大項目中講解一個子項目，在教師指導下學生完成第二個子項目，學生自主完成第三個子項目，并提交項目成果。拓展項目不占用課內學時，教學內容設計重復的是步驟，而不是內容，難度增加，能力逐漸遞進。
3 教學方法與手段改革
本門課程在實施過程中圍繞藍莓、蝴蝶蘭、馬鈴薯，采用項目教學、任務驅動、真崗實練等教學方法，以及多媒體教學、現場教學、課上課下相結合等教學手段。在教學過程中，利用QQ群、微信發任務，學生利用課余時間自主預習和準備教師發放的資料及任務清單，各個小組根據任務清單內容自己準備用具并清洗干凈。課內教學，首先教師利用多媒體教學講解基本知識點、重點和難點，利用網絡教學播放視頻資料，用示范教學法教師演示標準的操作技能。然后進入實操環節發放生產任務單和考核標準。采用小組討論、任務啟發的方法讓學生填寫生產任務單，教師檢查正確后開始進行操作，操作過程參照詳細的考核標準。整個實操環節教師在現場進行巡回指導，并糾正學生操作過程中出現的技術問題，要對本次課程進行總結與評價，學生小組互評需要改M的方面，教師進行總結，指出在本次課程中出現的問題。課后拓展采用上屆帶下屆的方式，成立課外興趣小組進行相關內容的課后任務。
4 課程考核
對于課程的總體考核采用理論考核+過程考核+大賽模擬考核的方式進行，要想技能有提升，理論知識必須要扎實，理論考核占總成績的30%，主要考核植物組織培養基礎的知識和技能點。過程考核中包括平時成績、項目成果、現場操作三部分，平時成績占總成績10%，主要包括出勤、提問發言、實訓準備等，每個項目的成果占總成績的20%，每個項目最終要提交成活的試管苗、項目總結報告?，F場操作占總成績的20%，主要是小組互評和教師評價，以教師評價為主。大賽模擬是按照國賽“植物組織培養”賽項的標準和要求進行，主要有三部分內容：MS母液配制、MS培養基制備、馬鈴薯組培苗的繼代培養，成績占總成績的20%。
作者簡介：張彩玲，碩士，副教授，研究方向：植物組織培養。
植物組織培養論文:論植物組織培養褐變產生的因素及對策
摘要:本文針對植物組織培養中常見的褐變現象,詳細地分析了其產生的機理及影響因素,并提出了相應的對策,為科研和生產提供了一定的理論和實踐依據。
關鍵詞:植物組織培養，褐變，對策
目前，在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
1.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
1.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
1.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。
1.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
2褐變產生的機理
2.1非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，并不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由于多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
3.1適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
3.2對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天后再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
3.3適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
3.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
3.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
3.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
3.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
3.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發生[10]。
3.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
3.4添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面
影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。3.5進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
植物組織培養論文:高校植物組織培養實驗管理模式
摘要：高校植物組織培養實驗所應用的實驗工具和儀器設備較多，實驗存在一定的危險性。加強對實驗的管理不僅能夠提高學生的實際操作能力，也能在很大程度上降低實驗的危險性。對高校植物組織培養實驗的管理模式進行探究，希望為今后的實驗管理工作提供理論上的支持。
關鍵詞：高校；植物組織培養實驗；管理模式
植物組織培養實驗是生命科學專業的重要實驗之一，該實驗能夠培養學生的應用能力和思考能力，在實驗課程中占據重要的位置。植物組織培養實驗作為一項綜合性的實驗，所要應用到的化學實劑、工具和實驗設備較多，其中不乏有毒有害、易燃易爆的物質和高溫高壓的設備工具，如果操作不當很容易發生危險，因此，必須加強對實驗的管理，提高實驗的完整性和安全性，保障實驗的順利進行。
1建立完善的實驗管理制度
在實驗開始之前，建立完善的管理制度，為實驗的進行提供保障。根據植物組織培養實驗的特點，可以建立組織培養室開放制度、儀器使用制度、藥品管理制度、安全制度、器皿清洗制度、登記制度、培訓制度、消毒滅菌制度以及管理人員責任制度等，保障實驗的順利開展和有序進行。如在學期開始時，實驗教師可以為學生安排一次培訓，為學生講解本學期需要完成的實驗以及在實驗過程中有哪些注意事項。安排學生參觀實驗室，使學生了解實驗的內容和實驗室的規章制度，從而更好地投入到實驗學習中。
2加強實驗過程的管理
2.1實驗室的使用管理
由于不同的實驗教師對實驗的要求有所不同，其需要的實驗條件也有著很大的差別，而實驗室的空間和資源有限，實驗條件無法滿足每一位教師的要求。這就要求實驗技術管理人員對實驗室做出合理的安排，解決好實驗過程中出現的各種矛盾，提高實驗室的利用率，將實驗室的作用發揮到較大。在具體的管理工作中，可在實驗室門口張貼看板，詳細記錄實驗室的使用情況和實驗室內部的各項參數，如光照情況、濕度、溫度等。也可以人為地創造實驗條件，如需要暗室培養時，可用遮光板將實驗室遮擋起來，人為創造一間暗室；在進行梯度培養時，由于所需的培養空間較小，可以使用培養箱來完成培養。將培養箱擺放在實驗室外的走廊上，擴展實驗室的使用空間，提高實驗室的使用率。同時也要根據教師和學生的時間靈活安排實驗，利用好實驗室的空當，將實驗室的作用發揮到較大。
2.2儀器設備的管理
組織培養實驗室的設備具有種類多、使用頻率高的特點，如果沒有進行妥善的管理，很容易造成使用上的混亂，影響實驗的正常開展，因此，必須加強對實驗室儀器設備的管理，提高設備的利用率。在管理中，首先技術管理人員要定期對設備進行檢查，確保設備的性能處于正常的狀態，一旦發現設備故障，及時進行維修或更換，避免延誤實驗。其次，技術管理人員要做好設備的保養工作，按照使用說明定期對設備進行保養，延長設備的使用時間。另外，技術管理人員還要完成實驗室的清潔工作，保護實驗環境。每周對實驗室地面和臺面進行消毒，每2個月清洗空調過濾網，保障實驗能夠在無菌的條件下開展。
2.3預備實驗的管理
由于植物組織培養實驗所應用到的實驗藥品較多，工作量較大，因此，在實驗開始之前，要充分做好準備工作。首先，將培養基藥品和其它藥品分開存放。培養基藥品包括微量元素、無機鹽、有機鹽以及激素類藥品，在存放上可以根據藥品的存放條件將這些藥品分柜存放，以免在取用時出現混亂。除培養基藥品外的其它藥品可按照其形態進行分類存放，將固體藥品和液體藥品來分，在每一種形態的藥品中又包含酸、堿、鹽、氧化物等不同性質的藥品，這些藥品的存放也要做到區別對待。對于危險性較大的化學藥品，可采用雙人雙鎖的管理制度，以此來保障藥品的安全。對于一些常用實劑，如1mol/L的KOH溶液和HCL溶液來說，要安排專門的人員進行管理，定期完成溶液的配制工作。對于高壓滅菌鍋等數量較少的設備，可以進行登記管理，也可安排多人同時進行實驗，提高實驗設備的使用效率。
2.4實驗進行時管理
在學生完成實驗的過程中，教師要對其進行完整的監督和管理，既要保障實驗的質量，又要確保實驗的安全。在這一過程中，首先，要加強對學生的安全教育，提高學生的安全意識，使其了解到危險藥品所能帶來的危害，從根本上保障實驗的安全性。其次，教師要讓學生明確實驗的流程，嚴格按照領用制度進行實驗用品的領用，保障實驗能夠有序進行。反復確認危險藥品的用途和用量，確保實驗的安全。另外，教師要確保每一個學生了解實驗操作規范，加強防范，采取必要的安全措施來保障學生的安全。保障實驗室防火、防漏器具的完整性，建立危險品記錄制度。
3積極改善實驗的環境
3.1加強教師隊伍的建設
教師隊伍承擔著教學和管理的任務，在實驗過程中起到了至關重要的作用，因此，必須不斷提升教師的素質，使其更好地參與到植物組織實驗的教學和管理工作中去。由于實驗教學所涉及到的內容較多，教學過程相對復雜，因此，教師必須要具備專業的素質，完整的掌握實驗知識，保障教學的質量。高校也要加強對教師的培訓，使其不斷更新自己所掌握的知識，更好地完成教學工作。在培訓的過程中，高校要做到以下幾點：一是有計劃地安排教師進行外出學習，使其能夠掌握先進的教學理念和教學知識，使教學工作能夠不斷獲得進步。二是優化教學工作者的年齡構成，加強對年輕教師的培訓，提高雙師型教師的比例，優化教師隊伍的構成。三是加強對教師技術上的培訓，如安排教師到設備公司完成設備知識的學習，以這種方式來提高教師的實際操作能力，提高設備的利用率。四是為教師搭建交流的平臺，使其能夠看到他人具備的優勢，看清自身的不足，從而激勵教師不斷進行自我提升。五是開展學術交流會，聘請的教育工作者來校進行講座，使教師對當前的教學現狀有所了解，不斷提高實驗教學的質量。
3.2構建學生交流平臺
組織培養實驗具有實驗步驟復雜、實驗周期長等特點，在操作上具有一定的難度。不論哪一個實驗步驟出現問題，都會對實驗結果造成巨大的影響，不僅會影響實驗的進度，也會造成資源上的大量浪費。構建實驗交流平臺能夠使學生更加深入了解實驗步驟，掌握實驗的方法，減少錯誤的發生，達到事半功倍的效果。在具體實施上，可以定期組織學生進行學術交流，在學術交流過程中，教師要利用多媒體設備為學生展示實驗的過程和實驗中所要注意的事項，使學生更加直觀了解實驗的步驟，吸取前人的經驗和教訓。教師也可以讓學生閱讀中外文獻，了解國內外的實驗進展情況，讓學生在學術交流會上完成交流，同時提出自己的問題，由教師統一解答。這種方式擴展了學生的視野，推動實驗工作的進一步發展。
3.3開放組織培養實驗室
將組織培養實驗室向學生（特別是本科生）開放，不僅能夠為學生實習實踐提供更好的物質條件，也為學生創建了一個良好的學習空間。學生在完成課題研究的同時，也能夠完成學習任務，達到了實驗學習的目的。實踐表明，實驗室可以通過以下幾種模式向學生開放：3.3.1向所承擔的實驗課題開放。在這一過程中，教師可以借鑒國外的導師制度，讓學生依靠自己的能力完成相關課題的研究，提高學生的思考能力和實際操作能力。學生通過自己收集資料、查閱文獻，解決了相關問題，掌握正確的學習方法。另外，學生所得出的實驗數據也為教師提供了一些基礎性的研究參考，對教師的工作有很大幫助。目前，很多高校已經開始實行一體化教學，將理論教學與實踐教學結合在一起，這種方式不僅激發了學生主動學習的熱情，也使學生的主觀能動性得到培養。3.3.2向畢業論文開放。畢業論文是教學的重要組成部分，也是檢驗學生實際能力的一種重要方式。如果學生的畢業論文涉及到植物組織培養的相關內容，教師可以向其開放實驗室。在此過程中，教師可對學生進行實驗的前期指導，幫助學生找到適當的方法，為學生提供便利的條件，使學生能夠更好的完成實驗操作，保障畢業論文的質量。3.3.3要將實驗室向興趣小組開放。很多學生對實驗學習抱有很大的興趣，對于這樣的學生，教師可以讓其組成實驗興趣小組，一同完成數據收集、材料準備以及實驗操作等工作。實驗教師可以擔任興趣小組的指導教師，同時選擇能力較強的學生擔任小組長。在教師的指導下，學生通過查閱文獻確定自己的實驗項目，自己設計實驗過程。將所要進行的實驗高職實驗室管理教師，在得到教師的同意后方可開始實驗。在實驗的過程中，小組成員可就實驗中遇到的問題展開討論，找到正確的解決辦法，如果以個人的能力無法解決相關問題，可向指導教師進行咨詢。這樣一來，學生獲得了自主學習的空間，其鉆研、創新的精神也得到了很好的培養。3.3.4要為參賽學生開放實驗室。學生在校學習的過程中會面臨很多參賽的機會，這些比賽能夠鍛煉學生的能力，提高學生學習興趣，因此，高校要為參加比賽的學生提供實驗條件，使學生完成參賽前的準備工作。在這一過程中，高校可為學生安排專業較強的實驗教師作為其指導教師，幫助學生解決實驗過程中遇到的問題，對學生的實驗行為進行指導，保障實驗操作的標準性和實驗的性。在實驗學習的過程中，教師也可以讓學生以小組為單位進行比賽，豐富教學的形式，提高學生的學習興趣。
4結語
植物組織培養實驗作為生命科學專業的重要實驗，具有實驗過程復雜、實驗藥品眾多的特點，因此必須加強對實驗的管理，提高實驗的效率。在管理中，要建立完善的管理制度、加強對實驗過程的管理、搭建完善的交流平臺、保障實驗合理有序的進行以及保障實驗的效果。
作者：張俊琦 單位：北京林業大學公共分析測實中心
植物組織培養論文:千里香植物組織培養的優化
摘 要：千里香為我國較常見的藥用植物，有麻醉止痛，消腫解毒等功效。本實驗以其新生幼葉及莖段為外植體，通過優化組織培養方法，篩選出適宜千里香生長的培養基體系，其中生長素的種類及含量對外植體的生長具有重要作用，同時，一定濃度的活性炭也可以有效地預防愈傷組織的褐化。經大量試驗發現適合千里香生長的培養基為：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次實驗旨在為千里香的無土大面積栽培提供新的方法和途徑，同時也為千里香在分子水平的研究提供無菌材料。
關鍵詞：千里香；組織培養；優化；生長素
基金項目：廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族醫學院校級課題。
千里香（Murraya paniculata）又名七里香、萬里香，為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物，原名小葉九里香，1978年黃成就將小葉九里香上升為種，更名為千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而廣泛分布于我國的廣西、云南等高海拔溫熱潮濕地區，植物體為常綠灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多種功效，是我國較常用的中草藥材。國內外學者對千里香的研究較少，且多見于對其化學組份以及藥理作用的探索，D.P. Chakraborty等人發現千里香植物體內含有一種新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人從千里香的葉子中提取了兩種氧甲基黃酮，具有抗菌消炎作用[3]；閆江紅等人利用HPLC法對千里香葉片中黃酮類成分含量進行了測定[4]。人們對該材料進行藥理分析的同時，對其組織培養方面以及分子蛋白水平的研究甚少，國內外暫時還沒有千里香植物組織培養的相關文獻，通過本次實驗，旨在為千里香進一步的分子水平以及蛋白水平研究提供無菌材料，提高其實驗性和成功率，同時，也為植物組織培養技術提供新的方法和途徑。
1材料采集
于2016年8月選擇晴朗天氣在廣西省百色市境內進行材料的采集，選擇生長健壯、污染較少、無病害的千里香植株，采摘帶腋芽的莖段、帶小葉柄的葉軸以及幼葉作為培養材料。
2方法
2.1外植w處理
將采集的實驗材料用無菌水沖洗8min。其中帶葉小柄的葉軸和帶腋芽的莖段分割成長約1cm的莖段，嫩葉邊緣全部剪掉，以便愈傷組織的生長，留下葉子的中心部分，約占原有葉子面積的一半以上。
2.2外植體消毒
將預處理好的外植體放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速轉入10%的次氯酸鈉溶液消毒3min，然后用無菌水沖洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用無菌水沖洗5次，將消毒后的外植體放在無菌濾紙上吸干表面水分后接種在胚芽誘導培養基中。
2.3培養基配置
誘導芽生長培養基
MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖
增殖培養基
（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L
（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖
（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L
（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L
2.4愈傷組織培養
初代外植體接種于誘導培養基中，培養條件為溫度為26℃，光照16h，黑暗8h，光強為2500lx的培養箱中培養，定期觀察和記錄外植體的生長及變化。
2.5 6-BA濃度梯度試驗
將長勢一致、誘導良好的外植體分別轉入不同濃度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培養基（1）中培養，每濃度試驗10瓶，培養30d。
2.6活性炭試驗
將誘導良好的外植體分別移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培養基中（2、3增殖培養基），進行抑制褐化實驗，每種培養基實驗10瓶，培養15d，觀察有無活性炭對外植體褐化影響。
2.7生長素種類試驗
挑選長勢好的材料放入含有一定濃度的IBA生長素的培養基中培養（4），每種接種10瓶，周期30d，與其他生長素進行對比。
3 結果與分析
3.1 不同6-BA濃度對愈傷組織的影響
6-BA為植物組織培養常用的細胞分裂素，可以有效促進細胞進行分裂，經過查閱相關文獻發現植物在組織培養過程中，該生長素的使用含量差異較大，例如林茜等人對四數九里香植物組織進行培養過程中[5]，6-BA增長濃度為1.0mg/L。王小敏等人在兩面針的組織培養與快速繁殖中[6]，6--BA的增長濃度為2.0mg/L，因而本實驗利用不同的濃度梯度培養，最終篩選出最適宜千里香生長的6-BA濃度為2.5mg/L。由表1可知，當外植處于不同濃度的6-BA培養基時，外植體均可長出愈傷組織，而當6-BA濃度為2.5mg/L時，培養基的發芽率較高，當6-BA濃度大于或者小于該濃度時，培養基的發芽率均明顯下降，因而，2.5mg/L6-BA濃度為最適宜培養千里香的濃度。
3.2 不同生長素種類對愈傷組織的影響
NAA、IBA均為植物組織培養常用的生長素，通過實驗對比，外植體處于不同培養基中發芽率略有不同，由表2可知，當外植體處于含有生長素NAA的MS培養基中，發芽率優于含生長素IBA的培養基，分析原因可能是INA促進愈傷組織生根，尤其是不定根的生長，以及外植體的生長效果等方面略低于生長素NAA。
x3.3 活性炭（AC）對愈傷組織褐化的影響
實驗發現，在千里香組織培養的各個時間段均有褐化的現象發生，這在一定程度上影響了千里香的生長，有實驗表明，褐化的發生及褐化程度對外植體的生長有一定的影響[7]，其中相對較大的材料褐化程度較輕，而較小的材料更容易發生褐化[8]。有報道稱，低濃度下的活性炭可以吸附培養基中的多酚氧化物及有毒物質，所以可以有效地防止外植體的褐化[9]。通過比較有無活性炭發現，當添加0.5mg/L的活性炭時，可以很好的抑制外植體褐化（圖1和圖2）。
3.4 溫度和光照對愈傷組織的影響
有研究發現，低溫條件可明顯降低褐化率，而高溫培養卻促進褐化的發生，當溫度較高時褐化率達52.7%[10]。但千里香適宜在溫熱潮濕的環境中生長，因而，選擇的組織培養溫度為26℃，外植體的褐化率較低，同時也符合千里香的生L環境。
培養光照不適亦對外植體的生長產生影響，趙伶俐等人研究結果表明，2000lx光強培養的外植體褐化率較嚴重，1000lx和3000lx光強培養可降低外植體的褐化率[11]，因而，本次實驗選擇2500lx光強，既可以有效降低褐化率也可以促進外植體生長。
4 結語
現代植物組織培養較常用的生長素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促進外植體的腋芽伸長生長，NAA可促進外植體的生根，本次實驗篩選出適宜千里香外植體進行組織培養的生長素濃度為6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同時，也驗證了活性炭可有效抑制外植體發生褐化反應，增加植物體的成活率，因而較為適宜千里香組織培養的培養基為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我國的一味中草藥材，有行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等功效，但人們主要研究其化學組成，至今還沒有看到相關組織培養的文獻，通過本次實驗，篩選出千里香較為適宜的外植體生長環境，將為千里香的無土栽培和進一步的分子實驗提供材料，也為其他植物的組織培養提供參考。
作者簡介：徐紅紅（1988.03），女，黑龍江省鶴崗人，碩士，助教，從事千里香組織培養及遺傳轉化工作。Emall：
通訊作者：潘永玖，Emall：
植物組織培養論文:我國木蘭科植物組織培養研究進展
摘要：文章論述了木蘭科植物組織培養研究的進展，對相關工作人員工作的開展有一定借鑒意義。
關鍵詞：木蘭科；基本培養基；誘導生根
木蘭科（Magnoliaceae）植物是世界著名的觀賞園林綠化植物，有些樹種亦是我國傳統的中藥材。木蘭科屬種資源豐富，全世界共有15屬250種，其中我國自然分布有11屬130種，占世界總屬的37%，總種的52%，居世界各國的首位[1]。木蘭科植物在系統發育中是一個最古老的類群，在被子植物中受到的威脅最多，是探索被子植物起源、發展和建立被子植物自然系統不可缺少的材料[2，23]。隨著實際應用的發展，木蘭科植物種質資源越來越欠缺，有30多種已被列入我國珍惜瀕危保護植物的名單之中[16]。所以越來越多的科學工作者關注木蘭科屬種資源的保護和資源開發問題。生物技術的發展，無疑給木蘭科植物的種質保存提供了非常好的理論基礎，有不少人開始利用組織培養技術進行木蘭科植物的種質保存和資源開發[3-8，10-15]。但大部分尚處于初步探索階段，根據資料記載，由組織培養誘導不定芽成功的僅在二喬玉蘭（Magnolia soulangeana）[8，17]、白玉蘭（Magnolia denudata）[7，32-33]、廣玉蘭（Magnolia grandiflova）[11，17，37]、荷花玉蘭（Magnolia grandiflor L.）[22]、紫玉蘭（Magnolia liliflora Desr）[24-33]、天女木蘭（Magnolia sieboldii K.Koch）[38]、凹葉厚樸[Maganolia biloba (Rehd et Wlis)Cheng][5]、川厚樸(Magnolia officinalia Rehd et Wils)[18]、巴東木蓮(Manglietia patungensis Hu)[20]、深山含笑（Michelia maudiae Dunn.）[6]、金葉含笑（Michelia foveolara Merr.et Dandy）[17]、長蕊含笑(Michelia longistamina)[17]、闊瓣含笑(M.Platypetala Hand-Mazz.)[17]、峨眉含笑(Michelia wilsonii)[17]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、火力楠（Michelia macclurei）[10，17]、樂東擬單性木蘭[Parakmeria lotungensis（Chun et C.Tsong）Law][17，21]、云南擬單性木蘭（Parakmeria yunnanensis Hu）[36]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]、北美鵝掌楸（Liriode ndron tiliptera）[17]、鵝掌楸（Liriodendron chinense Sarg.）[12，15，17]、雜交鵝掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[4，13，14，17，39]等幾十個種有報道，但經愈傷組織或不定芽誘導生根的成功例子僅在鵝掌楸（Liriadeadron chinease Hemsi Sarg）[12、15]、雜交鵝掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[39]、白玉蘭（Michelia alba）[7]、紫玉蘭（Magnolia liliflora Desr）[24]、云南擬單性木蘭[36]、巴東木蓮(Manglietia patungensis Hu)[3，20]、深山含笑（Michelia maudiae）[6]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]等極少樹種中有報道，而愈傷組織內次級代謝產物的研究分析未見有報道，見表1。本文就木蘭科植物組織培養的研究現狀做一綜述。
1 基本培養基和外植體的選擇
木蘭科植物都是木本或木質藤本，所以在外植體的選擇上常用頂芽、腋芽、嫩莖段，而葉、葉柄、托葉等外植體在脫分化并誘導愈傷組織產生上效果并不佳。一般而言，芽誘導產生愈傷組織的能力最強，而葉柄次之，葉片低。這在鵝掌楸屬[4，12，14，17，39]、含笑屬[6，25，34]、木蘭屬[24，31]等的研究結果是一致的。在荷花玉蘭的組織培養[22]中發現，花托產生的愈傷組織緊密腫脹，誘導率較高，葉芽次之，而雄蕊、雌蕊及花被片不易產生愈傷組織。這一點可以啟迪我們在其他屬的外植體選擇上可以拓開思路。王碧琴對7種木蘭科植物進行組織培養，研究結果認為：越是幼嫩的組織部分，越易形成愈傷組織，同時，易產生愈傷組織的外植體，很難分化出不定芽，所以在外植體的選取上，要從實際需要出發，根據植物個體性狀，做具體選擇，對于誘導不定芽，苗質組織較疏松的外植體，稍微取成熟部位并要多留莖節及生長點[17]。
合適的基本培養基是組織培養成功的一個重要因素，不同植物培養所要求的基本培養基有差異。目前植物培養采用的基本培養基主要為MS、B5、WPM、1/2MS等，每種培養基中鹽濃度不同，培養基中鹽濃度對外植體褐變和試管苗玻璃化均有影響。由表1可看出，木蘭科鵝掌楸屬植物的組織培養80%以上采用MS或改良的1/2MS，此外，WPM、1/2WPM、改良的Risser和White培養基也適合鵝掌楸的組織培養[12，14]。含笑屬植物的組織培養常采用MS[6，25，34]，生根時采用1/2MS或1/4MS。木蘭屬組培[5，7，18，22，24，31，32]中常用B5、MS培養基，在根的誘導上用1/2B5、、1/2MS或1/4MS，說明適當降低基本培養基中礦質離子的質量濃度有利于根的產生和生長。
2 培養基配比對愈傷組織產生的影響
2.1 植物生長調節劑物質
基本培養基提供給外植體最基本的物質條件，使外植體生存并保持低的生理活性，而植物生長調節劑能誘導細胞分裂、愈傷組織生長以及根芽的分化，常用的植物生長調節劑有：生長素類和細胞分裂素類。生長素類的主要作用是啟動有絲分裂，恢復植物細胞的分裂能力，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。細胞分裂素主要作用是促進細胞分裂和擴大，誘導芽的分化、側芽的萌發生長而抑制莖的伸長，使莖增粗，常用的細胞分裂素有激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）等。細胞分裂素和生長素常配合使用，使外植體生長和誘導效果更強。一般而言，植物生長激素通常被用來誘導愈傷組織形成和增殖，植物的生根多數是用生長素單獨實現。而愈傷組織產生后的增殖、分化再生植株或誘導細胞胚時，生長素應相應降低濃度或祛除，而細胞分裂素濃度適當提高。植物組織培養的器官發生途徑可分為：直接器官發生途徑和間接器官發生途徑，前者是指以芽或帶芽莖段直接誘導不定芽然后得再生植物，后者是指外植體經愈傷組織再誘導芽的再生途徑[3]。不同的器官發生途徑，在激素的選擇上有所不同。孫雁霞等[18]對川厚樸愈傷組織培養的研究中未用到6-BA，只用2，4-D和NAA，因其主要針對愈傷組織的增殖，所以沒有用到細胞分裂素。王琪[22]利用荷花玉蘭的花托和葉芽誘導愈傷組織，發現：2，4-D+NAA+IAA/6-BA的比值越大，愈傷組織誘導率越高，生長量越大。而劉賢旺等[5]對凹葉厚樸組織培養試驗中利用較高濃度的2，4-D（2mg/L）和較低濃度的6-BA（1mg/L）誘導愈傷組織的產生，愈傷組織的生長則適當降低2，4-D的質量濃度（1.0mg/L），提高6-BA的質量濃度（1.5mg/L）。在不定芽誘導后的增殖中，醉香含笑[34]、五味子[19]提高生長素/細胞分裂素的比值對不定芽有明顯的增殖效果，這與劉賢旺的愈傷組織增殖所需的激素配比恰恰相反。田敏[4]對雜交鵝掌楸的研究結果表明：高質量濃度的6-BA（2.0-4.0mg/L）能促進愈傷組織形成與不定芽的分化，蔣澤平等人[39]的研究結果與之相同，在其他因子不變的情況下，細胞分裂素所含質量濃度愈高，啟動越快，叢生芽也較多，由此看來細胞分裂素是誘導外植體脫分化和直接器官發生的關鍵因子?？v觀表1的實驗結果，激素的配比是因植物種類而異的，不可一概而論，而且激素配比是組織培養關鍵因素，在基本原理的指導下，我們只有通過不斷的摸索才能篩選出的配比。木蘭科植物組織培養常用的激素種類有：2，4-D、NAA、6-BA等。濃度范圍分別為：2，4-D（0.1，1-3mg/L）、NAA（0.02-0.5mg/L，4mg/L）、6-BA（1-3mg/L）。王琪在荷花玉蘭組織培養中NAA的應用達到4mg/L。此外IAA、KT、ZT、TDZ、BAP、IBA對木蘭科植物也是有效的生長調節物質，據報道，TDZ對木本植物組織培養來說最有效，已經應用于多種木本植物組織培養體系的建立[39，26，27]。
2.2 非植物生長調節物質
在基本培養基中除加入一定配比的植物生長調節物質外，還常加入一些非植物生長調節物質，如營養物質椰乳、水解乳蛋白、谷氨酰氨、蘋果汁、香蕉汁、豆芽汁等。木蘭科珍稀瀕危植物巴東木蓮在叢生芽的誘導時添加了10%的椰乳[3，20]，形成叢生芽苗，而未加椰乳的培養基中僅少數能叢生芽苗。劉賢旺比較了豆粉、水解乳蛋白、蘋果汁、香蕉汁、豆芽汁5種天然附加物對凹葉厚樸愈傷組織生長的影響，發現在培養基中添加10%豆芽汁能迅速促進愈傷組織生長。Civinova-B在研究樹木莖段培養時發現，加入天冬酰胺和谷氨酰胺能提高愈傷組織分化為芽的比率[44]。
3 誘導生根
木蘭科植物在愈傷組織誘導、不定芽產生、生根方面均較難[6，7，9]。以快速繁殖為目的的植物組織培養，誘導生根后方可用于工廠化快繁生產。木蘭科植物的組織培養只有含笑屬、木蘭屬、鵝掌楸屬等幾個屬的樹種有成功誘導生根的報道。陳金慧對鵝掌楸組培苗的生根及移栽技術研究結果表明：適當降低礦質元素的1/2MS培養基，附加IBA0.1mg/L生根效果較好，同時活性碳的使用可以有效提高組培苗的生根率。另外，生根能力隨所采集外植體的母本植物的年齡增加而下降。而蔡桁等對鵝掌楸組織培養技術研究結果表明：在生根培養中，以基本培養基WPM或1/2WPM添加NAA1.0mg/L好，而在1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+ABT0.1mg/L組合的培養基的生根率為60%。在以WPM或1/2WPM為基本培養基進行生根培養時，必須采用24h光照培養或先暗處理7-14天再用24h光照培養。由此看來，在鵝掌楸的生根培養中，選擇合適的生長素類物質及濃度，適當降低基本培養基的礦質元素，控制好光照是鵝掌楸試管苗生根要重點考慮的因素，此外，活性炭的使用，吸收了培養基中的有毒物質，防止褐變，也能大大提高生根率。樂東擬單性木蘭在1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L的培養基上，添加15g/L活性炭有利于生根[21]。楮建民在白玉蘭離體培養和快速繁殖中用到的生根培養基為：1/2B5+NAA0.5mg/L+AC1.0mg/L+VB20mg/L[7]。曾宋君在對深山含笑進行快速繁殖時認為：試管內小苗在1/2MS+NAA0.5mg/L的培養基上生根壯苗效果較好。周鑫對五味子組織培養中，生根培養基加入吲哚丁酸2mg/L，由此看來，適當降低培養基中的礦質濃度，添加適量的生長素類激素和活性炭有利于木蘭科植物試管苗的生根。而在巴東木蓮[20]生根誘導時除了以上條件的滿足外，還添加了BA0.05mg/L，但這種情況在木蘭科其他植物中不常見。
4 木蘭科植物組織培養中常見問題
木蘭科植物體內含有較多的酚類化合物，由于褐變引起組織培養失敗，已成為快速繁殖體系建立的一大障礙。褐變產生的原因與植物種類、基因型、外植體部位、生理狀態、培養基成分及培養條件等有關[42]，此外，接種中外植體大小與褐變也有關系，有報道[43]：當莖尖小于5mm時褐變嚴重，而7-15mm較輕。對褐化現象的機理研究及解決的方法等有較多的文獻報道。目前普遍認為褐變的機理有兩類：非酶促褐變和酶促褐變。非酶促褐變，不涉及酶類物質的產生，當細胞適應了脅迫環境就不在發生褐變[8]。酶促褐變是植物組織培養中褐變的主要因素，酶促褐變的發生必須具備3個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸轉氨酶，引起褐變的底物主要是酚類化合物。蘇夢云對樂東擬單性木蘭莖段愈傷組織誘導與褐變控制的研究表明：抗氧化劑控制褐變的效果比吸附劑好，以抗壞血酸好，其次是巰乙醇和二硫蘇糖醇[21]。參照已有的控制褐變的文獻報道，對于木蘭科植物在組織培養中出現的褐變問題提出以下幾點建議：春季取外植體，外植體以頂芽好；在抗氧化劑溶液中切割、剝離外植體，盡可能減少傷口切割面積；對外植體進行低溫冷藏處理；選用專門的木本植物培養基如WPM，或降低基本培養基中的無機鹽濃度，如采用1/2MS；初期培養可在黑暗或弱光下進行；在培養基中加入適量的抗褐變劑或吸附劑，如：抗壞血酸、植酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等；在培養過程中進行細胞篩選或多次轉瓶。
5 木蘭科植物組織培養的前景展望
木蘭科是研究被子植物系統演化非常重要的科，其植物資源的多樣性是系統理論研究的基礎。此外，在實際應用中，其許多植物在醫藥、化工、園林等方面有著廣闊的應用前景。而木蘭科大多為木本，稀藤本，分布區域狹窄，采種困難，扦插嫁接成活率不高，資源保護和開發比草本植物難度要大。利用組織和細胞培養技術可以對木蘭科植物進行快速繁殖、藥物生產、新品種開發等。如鵝掌楸、白玉蘭等植物已建立了較好的快繁體系，但大多數木蘭科植物還在摸索階段。姜長陽利用γ射線結合組織培養，選育出了一年開兩次花，生長快，抗逆性強的玉蘭新品系[30]，為園林綠化植物增添了亮麗的一色。通過組織和細胞培養生產次生代謝產物，已在人參、硬紫草上實現了工業化。西洋參、長春花、雪蓮、紅豆杉、青蒿等植物通過細胞培養生產次生代謝產物方興未艾。木蘭科植物利用組織和細胞培養生產藥物的研究起步較晚，童再康進行了厚樸組織培養和高產細胞系建立的研究，比較了不同愈傷組織內的酚類物質含量[30]。木蘭科植物利用組織和細胞培養生產藥物和香料等方面值得我們不斷深入研究。
作者簡介：劉葉蔓（1975-），女，湖南新化人，湖南中醫藥大學講師，研究方向：藥用植物生物技術的研究。
植物組織培養論文:開展植物組織培養校本課程的實踐探索
摘要：校本課程的實施，給學校教師帶來很大的自主性、積極性，與此同時，校本課程開發和實施的過程，也給教師也帶來一定的挑戰。本文以本校開展的植物組織培養研習課程為例，著重探討其開展過程是如何促進生物教師的專業發展的。
關鍵詞：校本課程植物的組織培養 生物教師的專業發展
“素質教育”從上世紀90年代就提出了，到21世紀又提出了“教育創新”，這使我們的教育觀念、教學內容、教育手段等諸多方面發生了重大變化。為適應新課程的需要，我校投資近30萬元，改建了植物組織培養室，總面積雖然只有70平方米，但實驗室的儀器配置都是很先進的，可以說麻雀雖小五臟俱全，能夠達到對學生進行研究性學習的教育、教學實驗操作平臺，為學生提供了非常好的實驗基地。2005年9月植物組培室正式啟用，我校生物學科面對新課程改革的需要與時俱進，積極開展了植物的組織培養校本課程的探索實踐。
一、植物組織培養研習課程的實踐探索
植物組織培養是一種在細胞水平上進行的生物工程技術。它是指離體的植物器官、組織、細胞以及原生質體，在無菌條件下利用人為設計制備的培養基，培養在人工控制的環境里，使其再生形成完整的植株、細胞或其它次生物質的一種技術方法。近年來，植物組織培養作為生物工程中的一項高新技術，它有高科技、高效益、高密度的特點，在一個較小的空間，用很少的外植體培養出大量的植株或物質，因而獲得很高的經濟效益。這在生產實踐和科研實驗中已被廣為采用，并引起社會各界的廣泛重視。
植物的組織培養課程的開設能讓學生早日了解和掌握一些先進的生物技術，在學習、參與探究和解決問題的過程中，養成嚴謹的治學態度、一定的科學研究能力和素養。這對于提高學生的生物學素質、形成科技志向、訓練可持續發展能力均具有重要的現實意義。
二、由植物組織培養課程實踐所引起的認識與思考
就本質而言，一般的校本課程開發的價值追求有三方面：學生個性的發展、教師專業的成長、學校特色的形成。這就是說，校本課程開發本身就是教師專業發展的有效途徑之一，下面就植物組織培養課程的開展，探討它在技能領域、精神領域、知識領域這三個方面是如何促進生物教師的專業發展的。
1.校本課程的開發提高了教師的課程能力和研究能力。
(1)課程能力
植物的組織培養技術是近幾年出現的研習課程，有的重點中學開展了很多年，他們有了很豐富的經驗。而我校則是剛剛接觸此項課程，毫無經驗可循。我們教師要自己確定課程目標、課程內容，還要負責課程實施、課程評估，因而必然有助于提高教師的課程能力。
①制定課程目標的能力
我們主要是通過對學生需求、學校環境、自身能力等3個方面的分析來確定課程目標的。因為是剛剛開展組培課程，組培過程、儀器操作我們也都不熟悉，所以我們把目標定在初級階段，進行初步探索：
Ｉ.初步實驗動手能力，如配制培養基母液、滅菌、儀器使用等基本技能，培養實驗的基本動手能力和科學技能。
Ⅱ.初步培養文獻檢索的能力。
Ⅲ.初步學會設計培養基配方，培養信息綜合能力。
Ⅳ.初步培養發現問題、分析問題、在一定程度上解決問題和創新思維能力。
Ｖ.學習與他人進行小組合作，培養合作交流能力。
研習課程開展的時間長了以后，會有很多經驗，我們制定的課程目標也會相應有所提高。
②確定課程內容的能力
確定植物組織培養課程內容或者說編制課程是一個創造過程，是教師對課程內容進行選擇，并加以組織的過程。組織培養技術在高中生物課程中的很多章節都有所介紹，但沒有一個完整的課程介紹組織培養的全過程，并且在高二上學期，學生剛開始學習生物，對組織培養很不了解，為了讓學生初步了解組織培養的含義及過程，我們查閱大量資料，確定上課內容，制作植物組織培養多媒體課件，并且制定了教學進度。
③實施課程的能力
課程實施包括教學、學生自學、作業等形式，但最為重要的是教學。每次上課之前，我們都要先查閱資料如“培養基配方”、“母液的配制方法”、“培養基配制程序”、“外植體消毒和接種”等等，并將這些資料打印、分發給學生。通過教學不斷地將打印的內容傳授給學生，將靜止的書面材料轉化為具體的教學內容，在配制培養基、接種等方面指導學生進行實踐操作，最終使它們成為學生的經驗。另外，因為同學們從未接觸過植物組織培養接種的過程，只在網絡和圖書上見過一些照片，為了讓大家對組培有個初步地認識，我們還組織同學參觀錦繡大地的植物組織培養車間，現場學習接種過程，效果極好。這些都大大提高了我們教師實施課程的能力。
④評估課程的能力
由于組織培養是基于學校而開發的，對我們而言，沒有現存的經驗可供參考，這就需要我們必須自己根據實際情況制定評價方案并實施評價。我們主要制定以下初步評價目標：
Ⅰ.評價學生，是否達到了預期的學習目標。
Ⅱ.評價課程，教學內容是否符合高中學生的學習特點，對學生的學習和能力培養產生的影響。
Ⅲ.自身評價，教學中如何引導學生，以后應如何編寫相應的教材等。
(2)實驗和研究能力
應該說，生物教師的專業水平距離生物專家還相差很遠，組織培養課程的開發本身是一個教師參與科研的過程，它要求我們教師承擔起研究者的任務，這對于教師研究能力的提高大有裨益。對于不同的學科，研究能力的含義是不同的，生物是一門實驗性科學，在組織培養的課程開發中，我們教師不僅要研究學校、學生、自己，還要研究課程目標、課程內容、課程理論、課程開發方法等；不僅要研究問題的解決，還要研究交往、協調的方法等等。如植物組織培養用的Ms培養基，不同培養基所加的生長素和細胞分裂素的量是不一樣的，為了達到效果，需要老師自己不斷的摸索；培養基所加瓊脂的量，不同的配方也不一樣，而它又會直接影響培養瓶中培養基的硬度和瓶內濕度，這也需要我們教師自己摸索經驗；又如外植體的切取時究竟切取哪一部分最合適，而且不同的植物適合取哪一部分的外植體，才更易分化和成活，也需要不斷地查閱資料，實際探索，然后再指導學生操作。
再比如：學生在課程剛開始時，對接種的操作還很陌生，動作生疏，很多細節沒有注意，結果接種的外植體大部分出現污染，這時我們沒有直接讓學生倒掉重做，而是坐下來認真分析失敗的原因，經過反思，學生總結出“接種時，有說話現象；培養基瓶離開超凈臺；操作器械消毒不嚴格”是失敗的主要原因，因此會在以后做實驗時，特別注意接種的規范性。我們教師也通過此次教訓，了解到了外植體接種過程中消毒徹底的重要性。
就是在這種不斷發現問題、解決問題和查閱資料的過程中，教師的實驗和研究能力逐步得到了提高。
2.校本課程的開展給教師帶來了一系列新的
觀念
校本課程是一種新的課程形態，比較注重學生本位，著眼于學生學習方式的改變，因而必然引起教學思想的變化。
組織培養課程是為學生開設的，我們生物教師所做的一切歸根到底是為了提高學生的生物科學素養，促進學生較大限度的發展。所以參與校本課程開發有利于教師形成以學生發展為本的理念，建立新的師生關系。
互聯網擴大了信息來源，教師不再是知識的、真理的化身。組培課程剛開始學習的時候，很多知識都是教師教給學生。隨著課程的深入，學生資料的豐富，學生在實驗的設計等方面的能力很可能超過教師，有時會把老師問倒。這就可能引發一種理念的重建：允許學生提出不同意見，甚至反對自己的意見，并想方設法使學生超過自己。
組織培養課程改變了學生原有的學習方式，采用的是研究性學習，這就必然會有這樣那樣的錯誤，因此教師要允許學生犯錯，但最重要的是總結經驗，下次不再出現同樣的問題。如果一個學生只知唯師是從，而沒有自己的觀點，不敢也沒有向教師質疑的習慣，那么不僅不利于學生自身能力的形成，也不利于生物教師的專業成長。
3.校本課程使教師改變了對知識本質的看法，而且為教師知識結構的改變提供了可能
(1)知識的本質
生物新課程的基本理念是“面向全體學生”、“提高學生科學素養”、“倡導探索性學習”，生物教學不僅要使學生獲取一定的知識，還要使學生習得獲取知識的方法，并使每個學生在其自身水平之上得到提高、獲得發展。
同樣，我們開展的植物組織培養課程重視的不是現存的、靜態的知識，而是強調學生自身的體驗；強調學生如何獲取有用的知識；強調那些能夠幫助學生思考與探索的東西。學生通過植物組織培養課程確實學會了組培的一些知識，能夠進行組培的一些操作，但更重要的是學生在整個過程中體會到了科學研究的過程，養成了嚴謹的科研習慣，學會了一些分析問題、解決問題的方法。這應該是學生參與組培課程所得到的較大收獲，也是我們老師所要達到的目的。
(2)知識結構的改變
教師參與植物組織培養課程的開發，首先要具有相應的植物組織培養的課程理論知識，而這些在現有教材只有少部分涉及，沒有現成的完整的內容，需要自己從各個方面收集資料。因此為了使自己的工作更具有成效性，我們就不得不認真學習一些組培課程理論，如四中陳穎老師編著的《“克隆”與組織培養》一書，閱讀其中大量的組培資料以完善自己的知識結構，以便用科學的理論指導自己的工作實踐。這就必然引起教師知識結構的重組。
就知識角度而言，生物教師的知識一般可以分為三大類：一是指生物教師所具有的特定的學科知識，如我們在大學所獲得的植物學、動物學、微生物學等方面的知識；二是教師所具有的教育學和心理學知識；三是生物教師在實際的教育教學工作中(包括研究性學習、選修課等課程中)獲得的具有明顯的經驗性的知識，是教師經驗的累積。這種實踐性知識的獲得正是教師專業發展的重要標準，因為對一個受過高等教育的生物教師來說，前二者的知識并不是太缺乏，教師專業發展主要是指獲得更多的實踐性知識。實踐性知識的獲得主要通過教師對自身教育教學實踐的反思，而反思正好是校本課程開發所特別強調的。
植物組織培養課程是我校一項新興的教學實踐活動，我們沒有現成的經驗可以借鑒，整個開發活動具有極大的不確定性，因而經驗的總結和反思就有其特殊的作用。生物教師可以在反思過程中對課程開發的過程具有更多理性認識，在課程目標確定的前提下，可以反思達到這些目標的方法，爭取少走彎路，不斷提高自己的實踐性知識。
三、結束語
我校的植物組織培養課程剛剛起步，同那些開展了很多年的學校相比，我們做的工作還太少，實驗教學經驗也不足。但是通過該課程的實施，我們確實感到了它促進了生物教師的專業發展，相信隨著我校組培課程的開展，我們的學生和生物老師都會在該課程中得到更大的收獲。
植物組織培養論文:外來入侵植物黃頂菊種子的組織培養
摘 要： 本實驗以黃頂菊種子作為外植體，首次對黃頂菊進行了組織培養。采用基本MS培養基，升汞消毒時間為4 min，在光照培養箱內采用不同溫度下的光暗培養。結果表明，黃頂菊種子的組織培養較易成功，本實驗確定了組培適合的培養基、消毒時間，以及培養條件。
關鍵詞： 外來入侵植物 黃頂菊 種子 組織培養
黃頂菊［Flaveria bidentzs （L.） Kuntze］是近年來新發現的一種外來雜草，原產南美洲，也叫“南美黃頂菊”，有的地方群眾也稱“野菊花”，為一年生草本植物，分類學上屬于菊科黃菊屬（Flaveria），與萬壽菊屬天人菊屬為近緣屬。2001年首次在天津南開大學發現，日前在河北邯鄲、邢臺、衡水、滄州、廊坊、石家莊、保定等地不同程度發生，呈現以河北省中南部為中心向周邊其他省市擴散趨勢?！包S頂菊”根系發達，耐鹽堿、耐瘠薄、抗逆性強，繁殖速度驚人，一株“黃頂菊”能產數萬至數十萬粒種子。“黃頂菊”能嚴重擠占其他植物的生存空間，有“黃頂菊”生長的地方，其他植物難以生存，一旦入侵農田，將威脅農牧業生產及生態環境安全［１］－［９］。
黃頂菊國內目前的研究主要集中在生理、生態、基礎防除方面，還有生物活性和化學成分等少量研究。黃頂菊在生存空間上占有極強的生態位，其生物成分和化學成分具有抗菌、殺蟲活性；另外對一些植物的發芽率及胚根的伸長有抑制作用，還對個別植物的胚根生長起到促進作用。從黃頂菊本身的生態特性及其提取物質的角度考慮，能否利用其體內的微生物，以及一些自身攜帶的物質來對某種生產上嚴重的病害進行防治實驗研究，從而達到使黃頂菊變廢為寶的目的，對其加以利用。本實驗考慮到在非生長季節對黃頂菊進行更多方面的研究，避免外界環境因素對科研實驗造成影響對黃頂菊進行了室內組織培養的探索。
1.材料與方法
1.1植物材料
黃頂菊種子，采自衡水湖碼頭。
1.2外植體的制備
將種子從植株上用雙手輕輕地揉搓下來，去掉摻雜在其中的帶有外表皮的種子，只將純凈的種子收集起來干燥環境下放置備用。
在無菌操作臺上用75%的酒精緝浸泡30s，0.1%的升汞消毒3.5min，4min，5min，無菌水沖洗3-4次，置于無菌培養皿中晾干，以此作為組織培養的材料［１０］。
1.3培養基的配置
未加任何激素的基礎MS培養基。
配制步驟為：MS培養基母液+加3%蔗糖定容調pH值至5.8加0.8%瓊脂，加熱溶解分裝20ml封口高壓滅菌（121℃，20min）接種［１０］。
1.4接種
在無菌操作臺上將消毒好且晾干的種子，用無菌的鑷子夾入到滅菌好的MS培養基上。封口后放入光照培養箱內培養。每瓶接種5粒種子。
1.5培養
將接種的三角瓶置于光照培養箱內，采用29℃下12h光照培養，26℃下12h黑暗培養，培養期為30d。
2.結果與分析
2.1升汞處理時間對外植體的影響
培養結果表明，升汞的處理時間不同（表1），外植體的出苗、生長狀況和污染情況都不同。其中，處理4min的結果好，外植體污染率為0，幼苗生長較快，長勢較好。處理3.5min的外植體污染率較高，說明消毒不徹底，造成出苗率較低。處理5min的外植體出苗率很低，也無污染，說明消毒時間過長。
②出芽率=出芽外植體數/接種外植體數×100
2.2種苗的污染
表1統計的污染率為外植體處的污染率，表明50%的污染率是由于升汞消毒時間的處理不當造成的，在25天的統計時，出現了培養基少量青霉等真菌的污染，推斷培養基、實驗器材的消毒都達到標準，不是造成污染的主要原因。所產生的污染主要是由于操作中偶爾出現的不規范操作所造成的，應該在操作中盡量嚴格規范，避免污染。
2.3種苗生長狀況
實生苗在營養豐富的普通MS培養基上長勢較好，15天左右的苗高可達0.5cm，30天的苗高可達1.5cm左右，有些可達2cm，但幼苗大部分較細弱，本實驗在后期的組培苗培養中將嘗試生長激素的加入，以促進苗木的增粗增長。
3.討論
組織培養過程中，選擇適當的培養基種類，激素的種類及添加量等時組培成功的關鍵。本文選擇組織培養用普通培養基MS，因為為初次對黃頂菊種子進行培養且考慮到激素可能對后續實驗的影響，所以本實驗沒有使用生長激素。
升汞的消毒時間是影響黃頂菊種子組培成功的關鍵。
本次實驗的造成污染的主要原因是種子消毒的不徹底，另有部分污染是由于操作過程中不規范的動作造成的。這提醒我們在組織培養的過程中，嚴格規范的操作程序也是影響組培苗成活及后期生長成功的關鍵因素。另外培養基的徹底滅菌和操作器皿的嚴格消毒也是不容忽視的因素［１１］。
由本實驗結果可知，黃頂菊種子的組織培養是比較容易成功的，這為我們在黃頂菊的非生長期內進行科學研究奠定了基礎。
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植物組織培養論文:植物組織培養中常見問題與對策
摘要：從植物組織培養中常見的污染、褐化、玻璃化現象等問題入手，分析了其形成的原因，并結合自身工作經驗提出針對性的解決策略，對植物的組織快繁和工廠化育苗具有一定的參考意義和借鑒價值。
關鍵詞：組織培養；污染；褐化；黃化
1 污染問題及對策
1.1 污染原因分析
控制污染是組培過程中的首要技術。造成污染的原因很多，如外植體的種類、取材的季節、時間、預處理方法、消毒藥劑的種類、濃度、消毒時間以及消毒方法、培養基和器皿滅菌、操作人員、工作環境的要求、超凈工作臺的工作質量等都與污染密切相關。一般來說，組培污染源分為3大類：材料帶菌、接種污染、培養過程感染。
1.2 對策
選擇合理的外植體種類、取材的季節、時間、初代接種選取大小適宜的外植體。在組培中應選取帶菌較少或不帶菌體的材料作為外植體。對母株預處理，改善植株栽培環境，對母株噴布殺菌劑或抗生素。改變滅菌方法，使用真空減壓滅菌、多次消毒滅菌、混合消毒液、灼燒等。在培養基中加入其它抑菌劑。切分潛在的帶菌材料時，要保障所用的接種工具已經過徹底的消毒；繼代培養時確保污染的材料應給予丟棄。針對接種污染，要做到紫外燈接種室消毒，清洗超凈工作臺；接種工具、材料不要與酒精燈、超凈工作臺鐵網面、臺面接觸；接種人員接種時用酒精棉擦手或用濃度為75 %的酒精噴灑雙手，接種時應穿上無菌的白大衣，戴上帽子和口罩；無菌室要注重平時除濕和熏蒸消毒工作。培養過程中要定期對培養室進行消毒處理，及時清除污染材料，污染的材料及儀器必須經過藥液消毒后方可使用。
2 褐化問題及控制措施
2.1 褐化概念及原因分析
褐化是指在植物組織培養過程中，外植體在誘導脫分化或再分化時，自身組織由其表面向培養基釋放褐色物質，以致培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐化一般分為2種：由于細胞受脅迫或其它不利條件影響所造成的細胞死亡而形成的褐化現象；由于酚類物質被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影響褐化的因素一般與基因型、外植體情況、培養條件、培養基有關。如溫度對褐化影響很大，高溫能使 多酚氧化酶的活性提高，促進酚類氧化；而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。
2.2 控制措施
多選擇幼齡植株取材，使外植體處于旺盛的生長狀態，可大大減輕褐變。在植株的一定部位取材，使材料中酚類物質含量較低，也有助于減少褐化。對母株進行遮光處理，不僅利于初代培養物的萌發，還可減輕褐化程度。利用硫代硫酸鈉、植酸、抗壞血酸等抗氧化劑、活性炭等吸附劑能夠阻止多酚氧化物對酚類物質的氧化作用，可減少或減輕褐變。實驗證明，瓊脂量的減少、較低的pH值也有利于減少褐變。選取適宜的培養條件如適度的低溫、初培暗光或弱光培養可抑制酚類的氧化，采用45℃以上的短時間高溫處理也能使多酚氧化酶失去活性，達到抗褐變的目的。
3 玻璃化現象及解決途徑
3.1 “玻璃化現象”內涵及發生原因
玻璃化現象是指在培養過程中材料呈半透明狀，組織結構發育畸形的現象。玻璃化的苗因組織畸形，分化能力降低，移栽后也很難成活，所以不宜用作繼代和移栽的材料。它已成為組培工作的一大難題，目前其根本原因尚無定論。根據吳若菁等[1]對香石竹的組培研究得知，影響組培苗玻璃化的原因主要與激素的種類、濃度、瓊脂的濃度、外植體的取材部位、不適宜的培養條件有關。
3.2 解決途徑
可從以下幾個方面降低或防止玻璃化現象的發生。①利用固體培養，調節培養基的 pH值，提高瓊脂濃度，降低培養基的襯質勢，造成細胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②適當提高培養基中蔗糖含量或加入滲透劑，提高培養基的碳氮比，降低 NH4+濃度，降低培養基中的滲透勢，減少培養基中植物材料可獲得的水分；③降低培養器內部環境的相對濕度，保持適宜溫度，改善氧氣供應狀況，減少玻璃化苗的出現；④適當降低培養基中細胞分裂素和赤霉素的濃度；⑤利用高于40℃的溫度對外植體熱擊處理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，實驗證明，玻璃苗放于自然光下幾天后，莖、葉變紅，玻璃化現象可逐漸消失，這可能與自然光中的紫外線有關；⑦改善培養容器的通風換氣條件，如用通氣好的封口膜封口。
4 其它問題及相關對策
如黃化現象和變異率高的問題。培養基中 Fe含量不足、培養環境通氣不良、培養溫度不適、激素配比不當、糖用量不足、光照不足等都會造成黃化現象。只有找出問題的根源對癥下藥才能從根本上解決問題。關于變異率高的問題，不僅不利于保存資源和培育優良的品種，還會嚴重影響工業化生產的組培苗的質量，必須從原始材料、培養基配方、增殖代數、愈傷組織等方面嚴控變異率的發生。
植物組織培養論文:植物組織培養及其在果樹上的應用
摘要植物組織培養是指利用細胞全能性培養再生植株的技術，由于其具有快速繁殖、產生脫毒苗、培育新品種、克服雜交不親和障礙和保存種質資源等應用優點，在果樹應用上有重要的價值。通過介紹植物組織培養在果樹上的應用，以為今后研究提供參考。
關鍵詞組織培養；果樹；應用
植物的組織培養是利用無性生殖原理，使植物組織在人工控制的條件下，通過細胞的增殖和分化，快速發育成新植株，是近幾十年來發展的新技術。利用植物組織培養技術在培育植物新品種和改良種性方面具有巨大的潛力，細胞融合可打破種屬間的界限，克服遠緣雜交不親和性障礙，不僅可以生產大量的優良無性系，保留植株的優異性狀，并可獲得藥用價值高和工業生產所需的次生產品；組織培養的植物細胞也成為在細胞水平上分析研究的理想材料。應用植物組織培養技術分離單倍體細胞，能選擇突變體，提高植物的品質，增強抗鹽、抗旱、抗寒等方面的能力，擴大植物的生長范圍；培育純合的二倍體優良品系，縮短育種時間；通過低溫冷藏體細胞，建立優良的基因庫，由此保存物種和種質資源。該文主要介紹植物組織培養在果樹上的應用，并提出今后的研究方向，可為今后的研究提供參考。
1植物組織培養概述
植物組織培養是指利用細胞全能性培養再生植株的技術，具有培養條件可人為控制、生長周期短而繁殖率高、管理方便等特點，其步驟可分為培養基配制、滅菌、接種、培養、馴化移植。在培養時可能會出現褐變、材料玻璃化等現象。
近年來，隨著科學技術的迅猛發展，植物組織培養技術已進入生產應用階段，廣泛用于科研和生產，近期應用的技術有快述繁殖、體細胞胚的發生、脫毒、胚培養、單倍體育種、種質貯存與運輸以及細胞代謝物的生產等，而體細胞無性系變異、通過原生質體融合進行基因轉化、通過農桿菌或其他手段向植物導入基因等又是很有發展趨勢的新技術。
2植物組織培養在果樹上的應用
20世紀60―80年代，在林業、農業、園藝等學科領域已廣泛應用植物組織培養技術，許多花卉、林木、果樹、蔬菜都可通過組織培養進行大規模離體快繁，試管苗已在國際市場形成產業化。國內外學者先后開始果樹組織培養技術的研究，目前已有很多關于果樹組織培養的研究報道。
2.1植物組織培養在蘋果上的應用
蘋果是我國重要的果樹栽培樹種，但單產低，品質差，嚴重影響蘋果生產的發展。通過育種手段選育優良的品種和砧木是解決存在問題的重要途徑。原生質體培養及融合技術能擴大遺傳重組范圍，促進遠緣性狀的有效轉移，在應用于育種實踐時顯示出巨大的應用潛力。
蘋果是落葉果樹中原生質體分離及培養研究比較早的樹種。Niizeki等[1]于1983年首次分離蘋果品種“Orel”的花藥愈傷組織原生質體，經培養獲得愈傷組織。費開韋等[2]于1980年在元帥蘋果花藥培養上獲得植株，為國內外首次獲得大蘋果單倍體植株。截至目前，已有12個蘋果基因型的原生質體經培養再生成植株。
組織培養能實現蘋果的快速繁育，尤其對特殊種植及蘋果矮化砧木的擴繁有重要意義。高兵等[3]通過研究不同消毒方法、消毒時間、防褐化措施、激素配比對組培苗的影響，從而獲得嘎拉蘋果單芽系組培苗。徐世彥等[4]以MS為基本培養基，取高酸蘋果莖尖和莖段做外植體，進行離體快繁研究，挑選確定其分化、生根培養基的激素組成及各激素的比例關系，并且成功地進行試管苗的移栽，且移栽成活率達到93.8 %以上。紅肉蘋果[5]、蘋果矮化砧GM256[6]等其他特殊蘋果種植的組織培養與快繁技術也在進一步研究中。
組織培養可作為蘋果脫毒的重要手段，生產無病毒苗木。周厚成等[7]以MS為基本培養基，以觀賞性小蘋果“特麗”的莖段為外植體，建立小蘋果“特麗”的無菌培養體系。張慶田等[8]以蘋果砧木M9、M26為試材建立其各自的無菌體系。
組織培養是實現細胞工程誘變的重要手段，對蘋果新品種的獲得有重要意義。李宗偉等[9]利用組織培養技術獲得扎矮山定子（Malus baccata）與平邑甜茶（M.hupehensis）雜交后代的優系93-10和93-24，提供了一種蘋果屬創新無融合生殖矮生砧木資源。
2.2植物組織培養在桃上的應用
楊寧等[10]對扁桃砧木試管苗生長的培養條件進行優化選擇，表明組合為6-BA 1.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA3 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L；極差分析結果表明，4個因子的重要性依次為6-BA、GA3、蔗糖、IAA。趙勝利等[11]于2008年初步建立山毛桃離體再生體系，研究結果表明：桃種子消毒方法為75%酒精（30 s）+0.1%HgCl2（5 min）+無菌水（24 h）+0.1% HgCl2（3 min）；種子去除種皮的萌發率較高；芽苗的增殖培養基為G+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；桃成年莖段誘導培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L十NAA 0.01 mg/L。桃保存培養基為G+KT 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。
2.3植物組織培養在葡萄上的應用
培育品質苗木是葡萄品質生產發展的基礎和關鍵，而選擇培養基是建立良好的葡萄組培快繁體系和再生體系的主要工作之一，由此再進行葡萄離體培養。在葡萄快繁研究中，國內外多采用MS、B5等培養基，同時應用各種細胞分裂素和生長素。法國的Georges Morel首先對葡萄進行組織培養，提出葡萄愈傷組織培養所需要的適宜生長素濃度。曹孜義等于1979年在國內首先報道葡萄試管繁殖技術，并于1980年建立我國及時個植物組織培養的葡萄園，而后有關葡萄莖尖快繁的研究越來越多。劉培德等[12]對貴人香、白羽等24個葡萄品種的莖尖進行再生研究，認為葡萄莖尖再生成功較易，只要是從旺盛生長的新梢上取下莖尖，接種到含有一定濃度的BA和NAA的MS培養基上，就能順利完成莖尖分化、芽叢形成和生根成苗。至今，葡萄莖尖離體培養已作為一項成熟的生物技術被運用到各個品種的研究，曹孜義等[13]于2002年研究獲得9個月繁殖2.32萬株生產用苗的結果，使葡萄試管苗工廠化生產達到更高的水平。
2.4植物組織培養在梨上的應用
趙勝利等[11]于2008年初步建立鴨梨高效再生體系，研究結果表明：梨種子在離體培養時需去除種皮，萌發培養基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，發芽率為86.67%；增殖培養基為L2，即Ms+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L；生根誘導培養基為G3，即1/4 MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L；生根數誘導培養基為1/2 MS+IBA 0.4 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。同時該試驗還研究鴨梨試管苗離體種質保存，結果表明：利用光照強度500 lx、添加活性炭3 g/L、大量元素減3/4、添加PP333 10～15 g/L瓊脂+水的空白培養基、添加甘露醇10 g/L結合30 g/L蔗糖、添加瓊脂8 g/L、添加甘露醇60 g/L、添加ABA 0.5 mg/L等方法對梨試管苗進行保存，好的已保存6個月，存活率在95%以上[11]。
2.5植物組織培養在核桃上的應用
核桃是世界四大干果之一，具有很高的營養價值和經濟效益，但利用無性繁殖較困難。因此，在核桃的生產中長期采用實生繁殖，通過扦插的核桃苗很難生根，嫁接成活率不穩定，導致良莠混雜、品種退化，嚴重制約我國核桃品種化的發展。隨著組織培養技術的興起，從20世紀60年代末期逐步開始研究核桃組織培養。Driver于1984年首次培養出奇異核桃生根苗。在國內，劉淑蘭等也以沙培實生苗及成年樹莖尖誘導出無根苗。張燕研究認為，采用80 μg/L青霉素和3 g多菌靈浸泡處理核桃外植體，控制污染的效果顯著。田愛梅研究指出，在培養基中加入5 mg/L抗壞血酸可有效抑制培養物褐化；采用誘導期暗培養、降低無機鹽濃度、添加活性炭等措施能有效地促進核桃芽苗的生根率。而張滿讓等[14]則應用WPM培養基培養早熟油桃，其較高萌發率為95.56%。
2.6植物組織培養在棗上的應用
在棗的生產中，傳統的育苗方式繁殖系數低，育苗速度慢，且浪費材料。近些年來，隨著紅棗的迅速發展，亟需大量品質苗木，為了滿足紅棗產業快速發展對苗木的需求，組織培養技術為快速育苗提供了一條新出路。
1980年，中國科學院植物研究所成功地在酸棗的組織培養中誘導大量的胚狀體，這是有關棗樹組織培養的最早的報道，以后此方面的工作得到廣泛的開展。其中發展最快的是利用棗樹的營養器官（莖段、莖尖）進行器官培養，建立快繁體系的研究工作[15]。
張福泉于1983年首次報道用棗莖段離體培養并獲得完整植株的研究。孫浩元以桐柏大棗為研究材料，以MS為基本培養基，對每個培養階段的培養基配方進行研究。段乃彬[15]研究認為，以棗頭莖段和根蘗莖段為外殖體，采用同樣的滅菌方式，根蘗莖段可極顯著地降低污染率。周瑞金首次建立辣椒棗離體葉片再生體系和高效的冬棗葉片再生植株快繁體系。隨著對棗組織培養的不斷深入研究，將會加快優良棗樹苗木的繁殖速度，從而進一步促進棗樹規?；l展。
2.7植物組織培養在其他果樹上的應用
應用組織培養技術進行植物離體快繁，現已被世界上很多苗圃用于多種果樹繁育，除了所提到的應用于蘋果、桃、葡萄、梨、核桃、棗外，其應用于杏樹[16]、柿樹[17]、櫻桃[18]、柑橘[19]、李[20]等其他果樹也有相關報道。
3結語
隨著植物組織培養技術的迅猛發展，果樹的組織培養技術已由實驗室走向商業化生產，成為現代生物技術的一個重要組成部分。隨著植物基因工程研究的迅速發展，將離體培養技術與分子生物學方法相結合，在細胞水平上進行遺傳修飾重組DNA，可以達到改良果樹品種的目的。人們力圖通過基因工程的方法獲得抗性強、產量高、品質優良的果樹新品種，隨著植物細胞工程與基因工程的結合，更大程度地提高了基因轉化的成功率。隨著科學技術的不斷進步，果樹組織培養技術發展水平將會得到進一步的提升，在果樹生產中將發揮更大的作用。
植物組織培養論文:植物組織培養基中添加蔗糖的原因
高中生物的質壁分離實驗中，用的分離劑是蔗糖溶液，能使成熟的植物細胞發生質壁分離，但因為蔗糖不能進入植物細胞內，故不能自動復原；而在植物組織培養時，培養基里要加入蔗糖，難道就不會發生質壁分離嗎?那么植物組織培養時植物細胞如何吸收利用蔗糖?
植物組織培養的初期(即再分化之前)，用于培養的外植體(用于培養的離體的植物組織、器官或細胞)基本上不能進行光合作用，需要在培養基中添加一些碳水化合物以供植物正常生活的需要。培養基中的碳水化合物通常是蔗糖，蔗糖除作為培養基內的碳源和能源物質外，對維持培養基的滲透壓也起重要作用。
蔗糖能進入植物細胞被利用嗎?早在20世紀40年代，有人曾做過這樣的實驗：將標記的蔗糖溶液直接噴灑到葉表面，剝去一小片葉表皮或角質層，蔗糖溶液就能進入細胞，這與外植體從培養基中吸收蔗糖極其相似；研究人員在葉片的韌皮部發現了一系列蔗糖運輸載體，包括菠菜蔗糖載體、馬鈴薯蔗糖載體StSUT1、車前草蔗糖-H+共運輸載體PmSUC2和2個擬南芥蔗糖運輸載體suc1和suc2；另有學者證明：在0.3g／mL(相當于30％)蔗糖溶液中，植物細胞發生質壁分離后可自動復原；另外在植物體內的莖和葉中都能夠合成蔗糖，是光合作用的主要產物之一，并且可以向其他部位運輸轉移，也是植物體內運輸的主要形式；這些實驗都充分表明了植物細胞可以吸收蔗糖(而在高中一般是說蔗糖分子不能進入細胞的)。
蔗糖分子是通過次級主動運輸形式直接被植物細胞吸收。次級主動運輸是細胞利用初級主動運輸的ATP酶或質子泵建立的質子梯度進行的物質運輸，并非直接利用ATP水解釋放的能量。經科學家研究，其吸收過程大致如下：質子泵將質子泵出細胞，胞外形成較高的質子濃度，建立起細胞內外的濃度梯度，這樣，胞外的質子順著濃度梯度趨向于向胞內擴散。細胞膜上的特殊載體(蔗糖一質子同向共運輸載體)除運輸質子外，連同蔗糖一起轉運至細胞內，這是一種蔗糖一質子同向共運輸。
植物組織培養中之所以以蔗糖作為碳源，主要有三個方面的原因：首先，同樣作為碳源為植物細胞提供能量來源，蔗糖較葡萄糖能更好地調節培養基內的滲透壓。配制相同質量分數的培養基，蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細胞脫水而生長不良。同時，植物細胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可相對長期的保持穩定。其次，植物組織培養過程中，要時刻注意防止培養基受到微生物的污染。微生物生長所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作為培養基的碳源，可一定程度上減少微生物的污染。再次，誘導作用，在培養基成分中，增加生長素的濃度，導致木質部形成，增加蔗糖濃度則導致韌皮部形成。當生長素水平恒定時，2％蔗糖使分化出的全部是木質部，4％蔗糖使分化出的幾乎全部是韌皮部，3％蔗糖則可以分化出兩者。所以，生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數量。因此，在植物組培中要選用蔗糖而不選用葡萄糖。
植物組織培養中，培養基中的蔗糖濃度較低的，一般為3％～10％，而質壁分離中的蔗糖濃度為30％，可見兩者濃度差距之大，質壁分離由于時間短，吸收速度緩慢，細胞吸收的量很少，而不是不能吸收，不足以對細胞液滲透壓造成影響，才會出現質壁分離現象。因而只要濃度不是過高，時間又足夠長，那么蔗糖就可以進入植物細胞內而被植物利用。同時植物體內有蔗糖轉化酶，可以吸收和利用蔗糖，而且轉化酶在高等植物蔗糖代謝中起著關鍵的作用，研究表明，轉化酶參與植物的生長、器官建成、糖分運輸等多項功能，因此在植物培養基中加蔗糖。
植物組織培養論文:植物組織培養實驗教學創新體系的研究
摘要：對植物組織培養實驗教學創新體系進行了研究，通過制訂科學合理的實驗教學大綱、優化實驗教學內容、建立開放式實驗室及改革考核辦法，來強化實驗教學效果，提高學生的實驗素質、科研素質、創新意識和創新能力、集體觀念和團隊精神，提高教學質量，培養學生的綜合實驗技能。
關鍵詞：植物組織培養；實驗教學；綜合技能
植物組織培養開創于植物生理學家Gottlied Haberland的細胞培養實驗，隨后各國學者經過半個多世紀的努力，終于觀察到胡蘿卜懸浮培養細胞的體細胞胚胎發生（Steward等，1958），并獲得黏毛煙草（Nicotiana glutinosa）和普通煙草雜種來源的單細胞再生植株（Vasil和Hildebrandt，1965），這些研究不但科學地論證了Haberland的細胞全能性理論，而且逐步完善了植物組織培養技術。在近半個世紀中，植物組織培養應用研究的各個領域得到突飛猛進的發展，推動了植物組織培養在植物育種、苗木快速繁殖和有用次生代謝產物生產等方面的應用。同時，植物組織培養又是植物基因工程和植物分子生物學研究的重要基礎之一。沒有植物組織培養技術，很難想象轉基因植物等許多研究能到如此迅速的發展。由此可見，植物組織培養來源于實驗科學，它是一門實驗性、實踐性很強的技術類課程，要求學生具有很強的實驗動手能力，因此，植物組織培養的實驗教學是這門課程教學的關鍵環節。張紅探討了植物組織培養實驗教學大綱的制訂、強化技能訓練、改革考核辦法；陳剛，冷春玲強調了開放式植物組織培養實驗室有利于開拓學生的創新能力及實驗技能的提高；姚曉惠，徐凌飛提出增加綜合性實驗，優化實驗教學內容，改進教學過程，成立興趣小組等有關植物組織培養課程的實踐教學方法。梁稱福等就植物組織培養課程教學方法進行了探討，從不同角度進行了植物組織培養理論教學的研究，探討了植物組織培養課程特色、教學與創新教育的實踐及課程教學方法。宋江華，張延紅等分別探討了園藝植物、藥用植物、園林植物等組織培養學課程教學過程中教學改革的思考與探索。盡管有關植物組織培養的理論教學及實驗教學開展了一些研究，但是，缺乏系統性和可操作性研究。隨著生物技術在科研與生產實踐中廣泛的應用，植物組織培養實驗技能亟待加強，植物組織培養的實踐教學需要不斷完善，培養適合生物技術在科研與生產上急需的人才。針對以上需求及我們多年從事植物組織培養的教學與科研工作的經驗，來開展植物組織培養課程實驗教學創新體系的構成和實踐研究，以滿足社會對這類人才的需求。
一、調整完善植物組織培養的實驗教學大綱
教學大綱是根據學科內容及其體系和教學計劃的要求編寫的教學性指導文件，科學合理的實驗大綱是提高教學效果的重要保障。植物組織培養實驗教學既要注重學生基本實驗技能的訓練，又要培養學生獨立思考和解決問題的能力。所以，根據植物組織培養課程的特點及目前學科發展的需要可以看出，調整優化實驗教學大綱勢在必行（見表1）。植物組織培養作為生物類專業（林學、花卉、園林、園藝及蠶桑等）的專業課，其學時一般為36學時，其中理論學時為27學時，實驗學時僅為9學時，植物組織培養的實驗耗時較長，一般需要3學時，9學時僅能開3個基本實驗，設計型、綜合型的實驗根本沒有條件開，這樣極大地限制了學生學習植物組織培養的熱情，同時很難使學生真正而系統地掌握植物組織培養理論及實驗技能。根據學科的發展及課程理論及實驗的要求，認為該課程學時設定為2.5學分較為合適（即45學時），其中理論學時為36，實驗學時為18，理論上11章，實驗開設6個。
二、優化實驗教學內容，增加綜合性、設計型實驗
將實驗內容分為3個模塊，即基本技能（也稱為驗證性）模塊、單項技能（設計型）模塊、綜合技能（綜合型）模塊，統籌兼顧了植物組織培養各個環節技能的培養。除基本技能項目外，單項技能與綜合技能項目都是在教師明確實驗目的及注意事項后，由學生自選材料、自主確定實驗環節（初代培養還是繼代培養）、自主設計培養基配方，并優化組培成本核算，以項目教學法的形式開展實驗活動。設計性、綜合性和創新性實驗達到80%以上。
三、建立開放式實驗室，提高學生的綜合技能
建立開放實驗室最突出的特點是，學生選擇自己感興趣的實驗而且有了自己可以支配的時間，從而調動學生的積極性，讓學生自己設計自己感興趣的實驗或是有一定難度但是可以自行解決的實驗，依據其操作步驟進行實地操作，提高其解決科學問題的能力，在實踐中收到了良好的效果。
1.實驗素質的提高。開放式實驗室的建立首先是注重學生實驗素質的提高。實驗素質是指學生進入實驗室的基本素養，具備良好的實驗素質是有效實施開放式實驗室的前提。
2.科研素質的提高。在開放式實驗室，學生們先后參與了教師的科研項目“地被植物歐石楠優良品種的引進及繁育技術”、“紅掌優良品種的快速繁殖及新品種選育”等項目的研究。通過參與實驗、通過現象觀察、數據的調查，在發現問題、解決問題過程中學會了查閱相關文獻資料，并采取自己掌握的科學方法認真總結歸納實驗結果等，提高了學生的科技水平素質，提高了其就業競爭力及實踐動手能力。在走入工作崗位后，有多名學生從事植物組織培養等相關技術工作，并有部分同學在就業單位擔任技術骨干。還有些同學考取了研究生，從事分子生物學方面的工作，由于有植物組織培養技術方面的訓練，實驗能夠很快上手，受到指導教師及其學長的肯定，對其迅速的生長具有重要的推動作用。學生通過親自參加科研活動，掌握了科學研究的基本方法，開拓了科研思路?，F今組培企業的發展需要大量的技術管理人員和研發人員，為學生的創業和就業提供了大量機會，我院每年都有部分學生被組培企業所吸收。
3.創新意識和創新能力的提高。結合學校大學生科技創新項目及泰安市科技創新引領項目的研究，培養了學生的創新意識，提高了學生的創新能力。例如，學生參加了山東農業大學大學生研究訓練（SRT）計劃項目“窄冠黑白楊組培快繁及再生體系的建立”、“歐石楠體細胞胚胎發育的研究”；泰安市大學生自主創新引領項目“猥實成熟種子愈傷組織誘導與植株再生的研究”、“歐石楠甲基化的研究”、“珍稀瀕危樹種青檀繁育技術研究與開發”、“常綠地被開花植物―歐石楠引種及繁育技術研究”等。培養學生的創新精神和實踐能力，促進學生知識、能力與素質的發展。在大學生科技創新項目及泰安市科技創新引領項目的帶動下，在學生中組建實踐小組，先由小組組織并開展實踐活動，即首先掌握植物組織培養的基本技術及基本的操作環節，如，培養瓶的清洗要求，培養基母液的配置，固體培養基的配置，外植體的采集，培養基、接種工具及無菌水的滅菌技術。學生在興趣小組實踐中使理論學習與科技實踐都有了一個很大的飛躍，鞏固加深了對書面課堂理論知識的應用和理解，促進了實踐技能的掌握、提高與創新，培養了學生的創新意識，提高了學生的創新能力。
4.集體觀念和團隊精神的提高。植物組織的培養有一個重要的特點就是持續的時間較長，比如，外植體的初代培養，一般的材料需要持續30天左右，在這期間會出現外植體的污染、褐化、玻璃化及材料的萌動、愈傷組織的形成、芽的分化等，需要給予適宜的培養條件及人為的操作，無誤及周期性的更換培養。因此，可采取在學生中成立實踐小組，利用平時的課余時間一起進行實驗項目的分工及操作，保障實驗材料適時轉接及污染材料的及時處理；利用平時的課余時間及周末休息時間和節假日，配置培養基、高壓滅菌、無菌接種，適時轉接，及時觀察分析，保障整個實驗的順利進行，這都需要團隊的整體配合及分工協調，在分組實踐中既培養了學生的協作意識和團隊精神，又鍛煉了他們吃苦耐勞和獻身科學的精神，使他們在一次次的探索實踐中不斷克服挫折、調整心態、銳意進取。
四、改革考核辦法，加大實驗教學的比重
為了使實驗成績能如實地反映出學生的客觀實際水平，改變以往僅以實驗報告作為實驗成績，采取多種考核方法相結合的形式，以提高學生的實驗技能，客觀反映學生的實際水平。采用綜合評定的方法確定學生的實驗成績，例如將實驗報告或實驗設計方案、實驗操作過程中的表現及實驗結果和集中考核三者結合起來評定。我們將組織培養的一些基本實驗技術作為技能考核內容。隨著教學經驗的積累和實驗教學條件的改善，我們相信植物組織培養課程的實驗教學質量必將更上一層樓。
作者簡介：李際紅，女，山東農業大學林學院教師，博士，副教授，主要從事林木遺傳育種與生物技術的教學與科研工作。